GB 31660.4-2019 食品安全国家标准 动物性食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的测定

GB31660.4—20192019-09-06发布2020-04-01实施食品安全国家标准动物性食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法Nationalfoodsafetystandard-Determinationofmegestrolacetateandmedroxyprogesteroneacetateresiduesinanimalderivedfoodsbyliquidchromatography-tandemmassspectrometry发布GB31660.4—2019前言本标准系首次发布。GB31660.4—20191食品安全国家标准动物性食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了动物性食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于猪、牛、羊肌肉、脂肪、肝脏、肾脏和牛奶中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中残留的醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮经乙腈提取，正己烷除脂，混合阳离子柱净化，甲醇洗脱，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。4试剂与材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1试剂4.1.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。4.1.2甲醇（CH3OH）。4.1.3甲酸（HCOOH）：色谱纯。4.1.4乙酸（CH3COOH）。4.1.5正己烷（C6H14）。4.1.6乙酸乙酯（CH3COOC2H5）。4.1.7乙酸铵（CH3COONH4）。4.2溶液配制GB31660.4—201924.2.10.2mol/L乙酸铵缓冲液：取乙酸铵15.4g，加水900ml使溶解，用乙酸调pH值至5.2，加水稀释至1000mL。4.2.22%甲酸水溶液：取甲酸2mL，加水溶解并稀释至100mL。4.2.30.1%甲酸水溶液：取甲酸1mL，加水溶解并稀释至1000mL。4.2.450%甲醇水溶液：取甲醇50mL，加水溶解并稀释至100mL。4.2.530%甲醇水溶液：取甲醇30mL，加水溶解并稀释至100mL。4.2.60.1%甲酸水乙腈溶液：取0.1%甲酸水溶液20mL，加乙腈溶解并稀释至100mL，混匀。4.3标准品4.3.1醋酸甲地孕酮（Megestrolacetate,C24H32O4,CAS:595-33-5）、醋酸甲羟孕酮（Medroxyprogesteroneacetate,C24H34O4,CAS:71-58-9），含量均≥98.0%。4.3.2内标：氘代醋酸甲地孕酮（megestrolacetate-D3,C24H29D3O4），含量≥98.0%。4.4标准溶液制备4.4.1标准贮备液：取醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮标准品各约10mg，精密称定，于100mL棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为0.1mg/mL的醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮标准贮备液。-20℃保存，有效期6个月。4.4.2内标贮备液：取氘代醋酸甲地孕酮标准品约10mg，精密称定，于100mL棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，配制成0.1mg/mL的氘代醋酸甲地孕酮贮备液。-20℃保存，有效期为6个月。4.4.3混合标准工作液：精密量取醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮标准贮备液各0.5mL，于50mL棕色量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度均为1µg/mL混合标准工作液。4℃以下避光保存，有效期1个月。4.4.4内标工作液：精密量取内标贮备液0.5mL，于50mL棕色量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为1µg/mL的内标标准工作液。4℃以下避光保存，有效期1个月。4.4.5标准曲线的制备精密量取适量混合标准工作液及内标标准工作液，用流动相稀释配制成浓度为２、5、25、50、100ng/mL的系列标准溶液（内标均为20ng/mL）。以特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。4.5材料4.5.1混合阳离子固相萃取柱：60mg/3mL，或相当者。4.5.2β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶。4.5.3微孔滤膜：0.22µm。5仪器和设备GB31660.4—201935.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。5.2分析天平：感量0.00001g和0.01g。5.3氮吹仪。5.4旋涡混合器：3000r/min。5.5超声波萃取仪。5.6移液枪：200µL，1mL，5mL。5.7离心机：10000r/min。5.8梨形瓶：100mL。5.9旋转蒸发器。5.10固相萃取装置。6试料的制备与保存6.1试料的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。脂肪组织于60℃水浴中融化。——取均质后的供试样品，作为供试试料。——取均质后的空白样品，作为空白试料。——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.2试料的保存-18℃以下保存，3个月内进行分析检测。7测定步骤7.1酶解取试样2g（准确到±20mg），于50mL离心管中，加内标工作液40µL，加0.2mol/L乙酸铵缓冲液4mL，涡旋混匀后加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40μL，于37℃下避光水浴低速振荡，酶解12h。7.2提取7.2.1肌肉、肝脏、肾脏组织试样经酶解后，加乙酸乙酯10mL，于旋涡振荡器上剧烈振荡10min，4000r/min离心5min，取上清液至梨形瓶中。残渣加乙酸乙酯10mL重复提取1次，合并上清液，50℃旋转蒸发至干。加乙腈10mL、正己烷5ml使溶解，转至50ml离心管中，低速涡旋10s，3000r/minGB31660.4—20194离心2min，弃正己烷层，下层液于50℃旋转蒸发至干，加30%甲醇水溶液3mL，溶解，备用。7.2.2脂肪组织试样经酶解后，加乙腈10mL，于旋涡振荡器上剧烈振荡0.5min，50℃超声提取10min，4000r/min离心5min，取上清液移至另一50mL离心管中。残渣加乙腈10mL重复提取1次。合并上清液，加正己烷4mL，低速涡旋10s，3000r/min离心2min，弃正己烷层。加正己烷4mL，再次除脂。下层50℃旋转蒸发至干，加入30%甲醇水溶液3mL溶解，备用。7.3净化混合阳离子固相萃取柱用甲醇、水各3mL活化，取备用液过柱，依次用水、50%甲醇溶液各3mL淋洗，抽干。用甲醇5mL洗脱，洗脱液于50℃下氮气吹干。用0.2mL乙腈（80%）-0.1%甲酸溶液溶解残余物，涡旋混匀，过0.22µm滤膜或15000rpm高速离心10min，取上清液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。7.4测定7.4.1液相色谱参考条件a）色谱柱：C18色谱柱（50mm×2.1mm,1.7µm），或相当者；b）流动相：A：0.1%甲酸乙腈，B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脱，见表1；c）流速：0.2mL/min；d）柱温：30℃；e）进样量：10µL。表1液相色谱梯度洗脱条件时间，min流速，mL/minA，%B，%0.00.220800.50.220801.50.290102.50.2505030.2208040.220807.4.2质谱参考条件a）离子源：电喷雾（ESI）离子源；b）扫描方式：正离子扫描；c）检测方式：多反应监测；d）电离电压：3000V；GB31660.4—20195e）源温：100℃；f）雾化温度：350℃；g）锥孔气流速：25L/h；h）雾化气流速：450L/h；i）定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表2。表2定性离子对、定量子离子、锥孔电压和碰撞能量化合物名称定性离子对及碰撞能量，eV定量离子对及碰撞能量，eV锥孔电压，V醋酸甲地孕酮385/267（20）385/325（18）385/267（20）45醋酸甲羟孕酮387/285（28）387/327（18）387/327（18）45氘代醋酸甲地孕酮388/270（18）388/270（18）457.4.3测定法取试样溶液和标准溶液，作单点或多点校准，按内标法以峰面积比计算。试样溶液及标准溶液中醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮与氘代醋酸甲地孕酮的峰面积比应在仪器检测的线性范围之内。试样溶液的离子相对丰度与标准溶液的离子相对丰度相比，符合表3的要求。醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮和氘代醋酸甲地孕酮多反应监测特征离子质量色谱图见附录A。表3定性确证时相对离子丰度的允许偏差相对离子丰度，%允许偏差，%＞50±2020～50±2510～20±30≤10±507.5空白试验除不加试料外，均按上述测定步骤进行。8结果计算和表述试样中待测药物的残留量按式（1）计算：mViSSiSiSSiSCAACCAAX………………………………（1）式中：GB31660.4—20196X—试样中被测物质的残留量，单位为微克每千克（µg/kg）；Cs—标准工作溶液中被测物质的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；Cis—试样溶液中内标的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；Cis’—标准工作溶液中内标的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；A—试样溶液中被测物质的峰面积；Ais’—标准工作溶液中内标的峰面积；Ais—试样溶液中内标的峰面积；As—标准工作溶液中被测物质的峰面积；V—试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；m—试料质量，单位为克（g）。计算结果需扣除空白值。测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9检测方法的灵敏度、准确度和精密度9.1灵敏度本方法的检测限为0.5µg/kg，定量限为1µg/kg。9.2准确度本方法在1µg/kg～5µg/kg添加浓度水平上的回收率为70%～120%。9.3精密度本方法的批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。GB31660.4—20197附录A（资料性附录）特征离子质量色谱图图A.1ng/mL混合标准溶液特征离子质量色谱图_________________________________Time0.501.001.502.002.503.003.504.00%00.501.001.502.002.503.003.504.00%00.501.001.502.002.503.003.504.00%00.501.001.502.002.503.003.504.00%00.501.001.502.002.503.003.504.00%0100208-std11:MRMof1ChannelES+3882703.81e42.03100208-std12:MRMof2ChannelsES+3873273.05e42.152.03100208-std12:MRMof2ChannelsES+3872851.20e42.150.310.102.031.831.090.862.852.372.553.003.24100208-std13:MRMof2ChannelsES+3853253.29e42.02100208-std13:MRMof2ChannelsES+3852674.21e42.04