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项目名称：蛋白质整体功能的在体遗传操作新技术新方法研究首席科学家：吴强上海交通大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：中国科学院1一、研究内容生物活体是生命活动体现的物质基础，也是最复杂最重要的研究蛋白质功能的对象。遗传操作是研究蛋白质活体功能最重要的方法之一。2007年诺贝尔奖授予的小鼠反向遗传学基因打靶技术有力地推动了蛋白在体功能研究。由于生命体经过亘古的进化选择，蛋白质家族在活体系统中形成了复杂的功能冗余性和表达协同性。由于正向遗传学突变和筛选的局限性，反向遗传学在研究蛋白质在体功能发挥着越来越重要的作用。在小鼠和果蝇模式生物中，基因打靶技术相继产生，有力地推动了生命科学的研究，但是现有基因打靶技术主要是单位点基因敲除，耗时费力而且效率还有待提高。本项目的总体设想是：以开发快速基因打靶方法为主线，以研究重要蛋白家族整体在体功能为核心目标，以小鼠和果蝇为脊椎动物和无脊椎动物的代表性模式生物，拟开发出高效实用的在体DNA大片段打靶新技术新方法，为蛋白质整体在体功能的研究提供高起点的技术平台，有力推动国家中长期蛋白质研究重大科学研究计划向前发展。本项目拟解决的关键科学问题是：开发快速基因打靶和在体DNA大片段基因打靶新技术新方法，推动我国小鼠和果蝇模式生物反向遗传学的发展，为国家蛋白质研究重大科学研究计划提供强有力的技术支撑体系。重点选择神经系统，表观遗传，以及肿瘤抗原等方面的重要功能蛋白质家簇进行新技术新方法开发研究。例如，我们选取了神经系统原钙粘蛋白和嗅觉受体蛋白质家族进行在体DNA大片段定向敲除的开发研究，这些蛋白质家族在脑发育和脑认知、神经连接复杂性和特异性、以及小鼠行为中具有重大科学意义，但其在体的整体功能研究又是瓶颈问题，我们试图在了解神经系统重要蛋白家族在体功能的基础上，认识神经系统的复杂性，可靠性以及其高度可塑性，为建立人类精神疾病的小鼠模型提供实验基础和技术平台，为将来治疗人类神经系统疾病提供有用实验依据。神经系统是最复杂的生命系统，在与环境的相互作用过程中具有高度适应性，同时神经系统在发育和脑认知过程中也具有高度可塑性。表观遗传和肿瘤发生也是生命科学研究的重大问题。我们所选取的主要研究目标是具有良好工作基础和重大科学意义，经过努力可以实现功能研究重大突破的蛋白质家簇。本项目将以小鼠和果蝇为模式生物，以神经系统重要细胞粘附和信号传导膜蛋白、表观2遗传组蛋白和黑色素肿瘤抗原蛋白家族在体研究为模式蛋白质家族，来开发DNA大片段定向敲除新技术新方法。编码这些蛋白质家族的基因通常是复杂的基因族，往往形成巨大的串联阵列，同时这些基因又具有高度相似性，其所编码的蛋白家族在漫长的进化过程中形成功能重复性和冗余性，因此蛋白质家族整体功能的在体功能研究具有重大挑战性。以基因打靶研究蛋白质在活体系统中的功能是国际上生命科学和生物技术的热点，小鼠和果蝇基因打靶技术是蛋白质在体功能研究最尖端技术之一。本项目的主要研究内容是：以犹他大学MarioCapecchi教授的小鼠基因打靶技术和KentGolic教授的果蝇基因打靶技术为基础，提高单位点基因打靶的效率，试图了解基因打靶在脊椎动物和无脊椎动物中的一般规律，为勾勒模式生物基因打靶全景图提供科学依据，并深入分析高效DNA大片段定向敲除的条件，建立在体DNA大片段定向敲除新技术新方法，为蛋白质研究重大科学研究计划提供强有力的模式生物反向遗传学技术平台基础。3二、预期目标总体目标：整合我国目前蛋白质在体功能研究反向遗传学领域的部分优势力量，综合利用国家蛋白质功能研究的成果积累，结合国际尖端小鼠和果蝇基因打靶技术，力争在DNA大片段定向打靶新技术新方法方面取得重大突破，为我国蛋白质研究重大科学研究计划提供国际领先的技术平台体系。重点选择在复杂神经系统细胞连接和信号传导，表观遗传和肿瘤疾病等方面具有重大科学意义，经过努力有望取得功能研究重大突破的蛋白质家族，对其整体的在体功能进行深入系统的研究，为阐明神经系统的复杂性和可塑性、表观遗传和肿瘤发生机理提供理论依据，为将来治疗人类疾病提供有用的实验数据。本项目以开展蛋白质在体功能国际前沿研究为目标，总体上力争开发出小鼠和果蝇高效实用的DNA大片段定向打靶新技术新方法，整体上达到国际先进水平并在某些技术领域处于国际领先地位，在蛋白质在体研究的国际前沿占有一席之地，开创我国利用反向遗传学进行蛋白质功能研究的新局面。项目五年预期目标：在技术方面，力求开发高效的在体DNA大片段定向打靶新技术新方法，突破目前体外方法的技术瓶颈和局限。同时努力提高现有单位点基因打靶方法技术的效率，以大大缩短基因打靶的周期；在理论方面，探讨小鼠和果蝇DNA大片段定向打靶的基本规律；在人才培养方面，培养出更多的具有蛋白质组学、基因组学、遗传学、神经生物学、肿瘤生物学和分子生物学等多学科背景，谙熟蛋白质在体功能研究遗传操作新技术新方法，具有很强原创能力的高级科学研究人才。总之，通过开发在体DNA大片段定向敲除新技术新方法，使我国在研究蛋白质家族在生物活体中整体功能的遗传操作技术达到国际领先水平，进一步提升我国在蛋白质研究领域的国际地位。在国际一流学术期刊上发表一系列较高水平的原创论文，并获得较多的引用，在小鼠和果蝇蛋白质在体功能研究领域占有一席之地，在国际上取得较大影响。培养一批富有原创能力且具有一定国际影响力的中青年科学家和学术带头人，为我国蛋白质整体功能的在体研究提供DNA大片段定向敲除新技术新方法，为蛋白质研究国家重大科学研究计划的进一步发展奠定坚实的技术和人才基础。4三、研究方案实现本项目预期目标的总体研究思路是：以小鼠和果蝇为模式生物，以开发高效实用的在体DNA大片段定向敲除新技术新方法为中心，利用常规的基因打靶技术定向定点地把loxP或FRT位点分别敲入到两个同源染色体目的基因簇的起始处和终止处，获取两个不同的小鼠或果蝇品系，通过此两个品系的交配获得复合杂合子，然后在Cre或Flp位点特异性重组酶的催化下获取基于Cre-loxP或Flp-FRT的跨等位基因重组，从而得到DNA大片段定向敲除动物品系。本项目研究的技术路线是：整合现有分子生物学和分子遗传学等蛋白质研究的技术方法，以常规基因打靶技术为基础，采用Cre-loxP和Flp-FRT位点特异性重组系统，通过在生物活体中同源染色体位点特异性的重组，开发研究蛋白质家族整体功能的在体DNA大片段定向敲除新技术新方法。我们将在小鼠和果蝇模式生物中分别验证Cre-loxP和Flp-FRT重组系统，通过对比Cre-loxP和Flp-FRT系统在小鼠和果蝇模式生物中的效率，探讨在体DNA大片段定向敲除新技术新方法的基本规律。在小鼠模式生物中，我们将利用Capecchi的常规基因打靶技术，把loxP位点打靶到目的基因簇的起始处，建立一个目的基因簇起始处包含loxP位点的小鼠品系。同时，我们也利用同样的基因打靶技术，把loxP位点打靶到目的基因簇的终止处，建立目的基因簇终止处包含loxP位点的另一个小鼠品系。然后，通过交配这两个不同的小鼠品系获得同源染色体目的基因簇的起始和终止处具有两个不同的loxP位点的复合杂合子小鼠。这两个loxP位点必需具有相同的方向性，才能保证位于两个loxP位点之间的DNA大片段可以在Cre重组酶的催化下被定向地敲除。同时设计Hprt-Cre小鼠交配方案提供Cre重组酶。这样就可以通过在体Cre-loxP跨等位基因重组获得目的基因簇的整体定向敲除。在果蝇模式生物中，我们将利用犹他大学Golic教授开发的常规果蝇基因打靶方法，把FRT位点打靶到目的基因簇的起始处，建立一个目的基因簇起始处包含FRT位点的果蝇品系。同时，我们也利用同样的基因打靶技术，把FRT位点打靶到目的基因簇的终止处，建立另一个目的基因簇终止处包含FRT位点的果蝇品系。这样就可以通过在体Flp-FRT的重组系统获得目的基因簇在果蝇中的整体5定向敲除。可行性：国际上遗传操作的迅速发展预示着DNA大片段定向敲除即将取得突破，小鼠和果蝇DNA操作的最新成果指明了蛋白质家族整体功能研究的发展趋势。在果蝇模式生物中，利用转座子可以随机地在基因组中插入FRT位点。当同源染色体上的两个转座子分别含有一个方向相同的FRT位点时，在Flp重组酶的作用下便可产生DNA大片段敲除，遗憾的是这些DNA大片段的缺失断点仍然是随机的，因此现有的果蝇DNA大片段敲除方法不具有靶向性。在小鼠模式生物中，通过两次体外操作可以产生ES细胞的DNA大片段敲除，但这个体外方法很耗时费力，更为困难的是取得种系传代。一种基于Cre-loxP和同源染色体在减数分裂中配对的体内方法（TAMERE）只可以实现相对较小的DNA片段敲除。另一种利用染色体自然交叉把位于两个不同的同源染色体上的loxP位点转移到同一条染色体上的方法（STRING）只能敲除非常大的DNA片段（severalmillionbasepairs），以达到一定的效率。虽然这些果蝇和小鼠的已有技术还存在着各种各样的缺憾，但是这些成果预示了在体DNA大片段定向敲除新技术新方法研究的发展趋势，以及取得蛋白质家族整体功能的重大技术突破的可行性。创新点：a)、单位点打靶的高效性：小鼠基因打靶和果蝇基因打靶技术在反向遗传学单位点打靶研究中是国际上研究蛋白质在体功能最尖端技术之一。但是由于实验周期长或打靶效率低等瓶颈问题，应用此技术非常耗时费力。我们将采用BAC重组技术，结合ET克隆和Gateway克隆技术，加上分子生物学技术的改进，大大缩短小鼠基因打靶质粒构建的时间，进而提高基因打靶的效率。b)、DNA大片段敲除的定向性：在我们的技术路线中，由于loxP和FRT特异性重组位点是通过Capecchi和Golic基因打靶的方法来敲入到小鼠和果蝇基因组中的，因此loxP和FRT特异性重组位点的敲入极具靶向性。通过敲入两个同方向的loxP或FRT位点，在位点特异性重组酶Cre或Flp的作用下，我们就可以取得任何DNA大片段的在体定向敲除，为蛋白质家族整体功能的在体研究开辟了重要途径。c)、DNA大片段敲除的在体（invivo）高效性：我们拟开发的基于跨等位基因重组的DNA大片段定向敲除新技术新方法具有高效在体的原创性，而且只通过动物的交配就能达到DNA大片段的在活体中的敲除，因此具有简单实用的特点。6课题设置：课题1、以原钙粘蛋白基因簇为模式来开发小鼠在体DNA大片段定向敲除新技术新方法。课题研究内容：以小鼠为模式生物，以快速单位点基因打靶为基础，以原钙粘蛋白为模式基因，通过位点特异性重组酶催化特异性位点重组，开发DNA大片段定向打靶新技术新方法，同时研究原钙粘蛋白基因簇在中枢神经系统发育和小鼠行为中的功能。还将利用基因编码的新型Ca2+荧光蛋白探针在特定细胞、组织、和器官的特异性表达，应用电生理及现代光学成像技术，在分子、细胞及整体水平上研究原钙粘蛋白家族的在体功能。课题研究目标：开发小鼠DNA大片段定向打靶新技术新方法，同时采用分子遗传学、神经生物学和行为学方法，研究原钙粘蛋白基因簇在神经发育和脑认知中的功能。承担单位：上海交通大学，生物物理研究所。课题负责人：吴强。经费比例：34%。课题2、果蝇DNA大片段定向敲除新技术新方法开发及其在组蛋白家族整体功能研究中的应用。课题研究内容：在果蝇中开发、研究大片段DNA在体定向敲除技术。用定点敲入两个FRT，结合FLP介导的同源重组技术，敲除果蝇基因组中靠近着丝粒附近的全部或部分组蛋白基因簇。探讨不同组蛋白量对细胞生长的影响及其机制；研究组蛋白上的表观遗传修饰的遗传机制。课题研究目标：建立高效、实用的果蝇大片段DNA在体定向敲除技术；同过对果蝇细胞内组蛋白质与量的研究，回答一些表观遗传学的核心问题。承担单位：生物物理研究所。课题负责人：焦仁杰。7经费比例：22%。课题3、利用小鼠DNA大片段定向敲除新技术新方法分析黑色素肿瘤抗原蛋白质家族整体功能。课题研究内容：为研究黑色素抗原蛋白质家族在肿瘤发生发展中的作用，我们将建立两个含有不同loxP位点的小鼠品系，通过交配达到