真菌基因组DNA提取试剂盒说明书

北京索莱宝科技有限公司第1页共3页真菌基因组DNA提取试剂盒说明书货号：D2300规格：50T/100T保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。产品简介：真菌是具有真核和细胞壁的异养生物，种属很多，已报道的属达1万以上，种超过10万个。真菌通常又分为三类，即酵母菌、霉菌和蕈菌（大型真菌）。对于酵母菌和霉菌，可以用玻璃珠处理，而对于大型真菌，可直接用液氮研磨。经过前期处理的菌液，用硅质膜吸附，即可得到高纯度的基因组。提取纯化后的DNA，可以直接用于PCR/Realtime-PCR，sequencing，Southernblot，mutantanalysis，SNP等下游应用实验。操作步骤：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。1、样品的处理：试剂盒内容：D2300-50TD2300-100TRNaseA1ml1ml×2蛋白酶K1ml1ml×2玻璃珠6g11g溶液A10ml20ml溶液B10ml20ml漂洗液15ml15ml×2洗脱液10ml20ml吸附柱50个100个收集管50个100个说明书1份1份北京索莱宝科技有限公司第2页共3页1）对于酵母菌，取1-2ml培养好的菌液，离心收集，弃上清。加入200ul溶液A，加入20ulRNaseA，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约5-10min。2）霉菌(孢子也可相同处理)：取50-100mg菌丝，加200ul溶液A，用玻璃研磨器适当研磨分散菌丝，加入20ulRNaseA，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约30min。3）大型真菌（如蘑菇等）：称取50-100mg样品，倒入适量的液氮，立即研磨重复3次，使样品研成粉末（如无液氮，可加200ul溶液A后用玻璃研磨器适当研磨），加200ul溶液A，加入20ulRNaseA，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约5min。2、加入20ul的蛋白酶K（10mg/ml），充分混匀，55℃水浴消化30min，消化期间可颠倒离心管混匀数次。12000rpm离心2min。将上清转移到一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心。3、在上清中加入200ul溶液B，充分混匀。如出现白色沉淀，可放55℃水浴5min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致上柱后堵柱子，请增加消化时间。4、再加入200ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，放置2分钟。5、12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。6、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。7、向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。8、12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。9、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温北京索莱宝科技有限公司第3页共3页放置5min，12000rpm离心1min。10、离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。注意事项：1.由于真菌种类万千，对于一些特别难处理的真菌，可用液氮研磨，再用玻璃珠振荡，蛋白酶K处理，一般都可以得到一定量的基因组DNA，如电泳检测很弱，一般PCR都会有较好结果。2.若溶液A或溶液B中有沉淀，可在55℃水浴中重新溶解。3.如果DNA提取量很少，可加长玻璃珠处理时间，如果提取DNA成弥散短条带，可减少玻璃珠处理时间。4.洗脱缓冲液的体积最好不少于50ul，体积过小会影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。5.DNA浓度及纯度检测：得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。6.在确保样品无误的情况下，如经过多次试验，都无法提出DNA，请将部分样品寄至我公司，我们代为摸索优化条件，以使您的实验能够正常进行下去。