基因结构与表达分析的基本策略

1基因结构与表达分析的基本策略StrategyforStructureandExpressionAnalysesofGenes分子生物学系22分子生物学的三大核心技术DNA序列分析—DNA测序，1977聚合酶链式反应—DNA扩增，1985DNA重组技术—基因克隆，19733一、DNA序列分析二、核酸分子杂交三、聚合酶链式反应四、基因芯片和微阵列五、Western免疫印迹主要内容4（一）双脱氧末端终止法(Sanger,1977)一、DNA序列分析（二）DNA自动化序列分析（三）化学降解法(Gilbert,1977)5FrederickSanger1918～WalterGilbert1932～TheNobelPrizeinChemistry1980PaulBerg1926～6DNA测序技术基础：高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）技术，可分离差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。7(一）双脱氧末端终止法（dideoxychaintermination）8ATP、dATP和ddATP的结构ATPAOHOHHHdATPddATPNTP:核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP的合称；dNTP:脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP；ddNTP:ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP；9掺入N个核苷酸DNA合成反应模式图10DNA单链模板引物掺入ddNTP延伸的新合成链末端终止111.双脱氧末端终止法原理DNA合成反应中，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP。12ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPAGCT5′T4711GAATGA3′ACGCT132.DNA测序主要步骤14A反应管G反应管G反应管T反应管C反应管T反应管1516GATC17●变性聚丙烯酰胺凝胶电泳●单链DNA模板的制备●DNA模板与测序引物退火●掺入法标记反应●延伸-终止反应●放射自显影●阅读测序结果测序步骤18（二）DNA测序自动化原理采用4种不同的荧光分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。19ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5′TGAATGA3′ACGCT2021表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为C和T,因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一个峰C或者T，则该位点基因型为CC或TT纯合型22DNA自动测序步骤4种不同荧光染料标记终止物ddNTPsSanger测序反应反应产物同一泳道电泳分离激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序23DyelabeleddideoxyterminatorsonABI3730capillaries24与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础上。（三）化学降解法25将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记，标记的DNA片段分成五个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种（类）碱基处断裂。电泳分离5组DNA混合物，放射自显影检测末端标记的DNA链的电泳区带位置。化学降解法原理26化学降解G反应模式图硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet27最新测序技术•454技术(Roche)•焦磷酸测序（Pyrosequencing）•Solexa测序技术(Illumina)•SOLiD技术(ABI)•连接法测序28举例：Solexa测序HiSeq200029•Solexa测序：在一个反应中同时加入4种核苷的标签，采用边合成边测序（SBS－sequencingbysynthesis）。完成人类基因组草图不同测序仪的比较图30二、核酸分子杂交（NucleicAcidHybridization）（一）Southern印迹杂交：检测DNA(Southernblothybridization)SouthernEM,1975（二）Northern印迹杂交：检测RNA(Northernblothybridization)StarkGR，197731核酸分子杂交原理标记的单链核酸探针与待检测的靶单链DNA或RNA局部互补结合形成杂交双链。应用：核酸靶DNA或RNA序列的定性与定量分析。323333印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”,译为印迹技术。3434探针技术用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”。探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。35Southern印迹杂交原理将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。（一）Southern印迹杂交应用：DNA（基因组DNA）分子的定性或定量分析。361.制备基因组DNA2.用限制性内切核酸酶消化基因组DNA3.琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段4.凝胶预处理（如强碱，DNA双链变为单链）5.Southern印迹转移6.标记核酸探针、探针与DNA片段杂交7.杂交结果显示Southern印迹杂交基本过程37Southern印迹杂交示意图38将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。3940地中海贫血的Southernblot基因诊断（1）仅一条染色体上的一个α基因缺失或缺陷，则α链的合成部分受抑制，称为α+地贫；（2）每条染色体上的2个α基因均缺失或缺陷，称为α0地贫；(3)α1、α2序列基本一致；基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。α1α2αααα+α+α+αα0α+α0α0α041BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe地中海贫血的直接基因诊断42αα/αααα/α-αα/--α-/----/--正常缺1缺2缺3缺414kb10kb43（二）Northern印迹杂交(Northernblothybridization)指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。用于mRNA进行定性和定量分析。44RNA琼脂糖凝胶电泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblothybridization28S18S应用举例45GAPDH0d2d4d6d8dNorthernblot杂交分析mRNA的表达靶mRNA3-磷酸甘油醛脱氢酶4646三、其他杂交技术1.斑点杂交(dotblothybridization）将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。47472.原位杂交（insituhybridization）用标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序列杂交，可对核酸进行定性、定位和相对定量分析。483．核酸酶S1保护分析法(nucleaseS1protectionassay）单链DNA探针与待测RNA形成DNA/RNA杂交双链，加入核酸酶S1专一性地降解未形成杂交体的DNA或RNA单链，DNA/RNA杂交双链则受到保护而不被降解。494．RNA酶保护分析法（RNaseprotectionassay，RPA）50RPA基本程序：●待测RNA的分离●体外转录标记RNA探针●待测RNA与探针RNA进行液相杂交●RNA酶消化●不同大小杂交片段凝胶电泳分离51三、聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)（一）PCR技术原理（二）耐热DNA聚合酶（三）PCR引物及设计原则（四）PCR条件的优化（五）PCR改进技术（六）其它PCR技术52聚合酶链式反应(PCR):（一）PCR技术原理MullisK.1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。TheNobelPrizeinChemistry199353ThereplicationofDNA54原理：PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。其主要热循环过程为：变性、退火、延伸三个步骤。551.PCR循环由三步组成：①变性（denaturation）②退火（annealing）③延伸（extension）高温合适温度合适温度5657582.PCR扩增终产物大小:介于两条退火引物5′末端之间的双链DNA片段。循环一59循环二60循环三61一对引物：正向和反向限制了PCR扩增的片段的范围5/——5/—3/3/—5/——5/—3/3/—625′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGCAGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCGAGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG3′GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT3.引物设计实例63Y=A（1+E）nY:扩增产物的量A:最初靶DNA分子数E:PCR扩增效率n:循环次数3.PCR产量当E＝100％,A=1时Y=2n2n(引物延伸产物的量）64（二）平台期与平台效应1.平台效应（plateaueffect）：PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入线性增长期或静止期，即平台效应。影响因素：①引物及dNTP底物浓度降低。②酶与模板比例下降。65PCR平台效应66（二）耐热DNA聚合酶1.TaqDNA聚合酶（实现了PCR自动化）从嗜热水生菌thermusaquaticsYT-1株中直接分离出来。●95℃的半衰期:40min●最适温度:72℃～80℃●催化反应速率:150～300核苷酸/秒/酶分子6768TaqDNA聚合酶特性：●5′→3′聚合酶活性；●5′→3′外切酶活性；●较弱的非模板依赖性；●缺乏3′→5′外切酶活性。69PCRthermalcycler70PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR产物71无机离子及抑制剂的影响TaqDNA聚合酶的活性对Mg2+浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。最适Mg2+浓度：2mmol/LK+浓度：50mmol/L72几种高保真的耐热DNA聚合酶1.TthDNA聚合酶2.VentDNA聚合酶3.PfuDNA聚合酶73（三）PCR引物设计原则引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸DNA或RNA片段。DNA复制引物：单链RNA片段PCR引物：单链DNA片段74PCR引物设计原则：1.引物与模板的序列要完全互补2.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3.引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(错配)755′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′特异扩增5′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′错误引发1.引物