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专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具[学习目标][核心素养]1.简述DNA重组技术所需的三种基本工具及其作用。2.基因工程中作为载体需要具备的条件。3.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。1.科学思维：模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。2.社会责任：关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。读教材、抓双基自主预习一、基础理论和技术的发展催生了基因工程1．基因工程的概念手段通过体外1____________和2________等技术，赋予生物以新的遗传特性目的按照人们的愿望，进行严格的设计，从而创造出更符合人们需要的新的3__________和生物产品DNA重组转基因生物类型设计和施工水平4____________水平原理5__________操作环境生物体外DNA分子基因重组2.基因工程的基础理论和技术支持a．DNA是遗传物质的证明b．基因转移载体的发现c．工具酶的发现d．遗传密码的破译e．DNA体外重组的实现f．重组DNA表达实验的成功g．PCR技术的发明h．DNA双螺旋结构和中心法则的确立A．基础理论：6________B．技术支持：7____________adhbcefg二、基因工程的基本工具1．限制性核酸内切酶(又称“限制酶”)——“分子手术刀”(1)来源：主要来自8__________。(2)种类：分离出了约9_________种。(3)特点：具有专一性。①识别双链DNA分子的某种10________________。②切割11________________中的特定位点。(4)作用：断开两个核苷酸之间的12____________。(5)结果：产生13__________或14________。原核生物4000特定核苷酸序列特定核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端平末端2．DNA连接酶——“分子缝合针”(1)种类种类比较项目E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只能将双链DNA片段互补的15__________之间连接起来既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的16________黏性末端平末端(2)作用结果：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被17________切开的两个核苷酸之间的18____________。(3)DNA连接酶和限制酶的关系限制酶磷酸二酯键3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)作为载体必须具备的条件条件目的有一个至多个限制酶的切割位点供19________________(基因)插入其中在宿主细胞内稳定存在并具有自我复制能力目的基因稳定存在并保存特殊的20______基因重组DNA的鉴定和选择外源DNA片段标记(2)种类：21______、动植物病毒和λ噬菌体的衍生物等。(3)载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。质粒三、重组DNA分子的模拟操作1．材料用具：剪刀代表22______，透明胶条代表23______________。2．切割位点(1)分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出G—A—A—T—T—C序列，并选G—A之间作切口进行“切割”。(2)再从另一条链上24____________之间寻找EcoRⅠ相应的切口剪开。DNA连接酶互补的碱基EcoRⅠ3．操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端能25__________；否则，说明操作有误。互补配对1．判断下列叙述的正误。(1)基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。()(2)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。()(3)DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。()√××(4)限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。()(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。()(6)DNA连接酶能连接所有相同或互补的黏性末端，故该酶没有专一性。()×√×2．下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是()A．一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列B．限制性核酸内切酶的活性受温度、pH的影响，总有一个最合适的条件C．限制性核酸内切酶能破坏相邻脱氧核苷酸之间的化学键D．限制性核酸内切酶不只存在于原核生物中，其合成场所是核糖体解析：选A限制酶只能够识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列，不能识别RNA分子的核糖核苷酸序列，A错误；同其他的酶一样，限制酶同样受温度和pH的影响，而且具有发挥最大催化效率的最适温度和最适pH，B正确；限制酶催化的是特定部位磷酸二酯键的断裂，属于水解反应，C正确；限制酶主要从原核生物中分离纯化，也有来自真核细胞的，其本质是蛋白质，在核糖体上合成，D正确。3．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是()A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点C．携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定选择解析：选D质粒不只分布于细菌中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布，A项错误；并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点而成为合适的运载目的基因的工具，B项错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C项错误；质粒上的抗性基因常作为标记基因，D项正确。解疑难、提能力课堂探究探究点一|基因工程的工具酶|核心探究|一、限制性核酸内切酶(限制酶)1．来源：主要从原核生物中分离纯化而来。2．特点(1)具有专一性，表现在以下两个方面：①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列；②切割特定序列中的特定位点。(2)大多数限制性核酸内切酶的识别序列由6个核苷酸组成，但也有少数限制性核酸内切酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。3．识别序列的特点呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线(如图)，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。如GCCGGCCG以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CCAGGGGTCC以AT为轴，两侧碱基互补对称。4．作用结果：限制酶切割DNA产生的DNA末端有黏性末端和平末端两种形式。[特别提醒](1)限制酶是一类酶而不是一种酶。(2)限制酶不切割自身DNA的原因是该生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰。(3)获取目的基因和切割载体时常使用同种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。也可用不同的限制酶切割，但必须能产生相同的黏性末端。不同限制酶切出的黏性末端未必不同，如GATC↓和GGATCC↓序列不同，但经限制酶处理后形成的黏性末端相同。(4)限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。获取一个目的基因需限制酶剪切目的基因的两端，共产生4个黏性末端或平末端。二、DNA连接酶1．作用：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来实现的。2．连接方式：DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶作用实质都是催化形成磷酸二酯键是否需模板不需要需要连接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键作用结果将两个DNA片段连接成重组DNA分子合成新的DNA分子[易错易混](1)回文序列：限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为GAATTCCTTAAG，为回文序列。(2)限制酶与DNA连接酶的作用部位和作用区别：限制酶和DNA连接酶作用部位相同，但作用正好相反，都作用于特定部位的磷酸二酯键，前者是“切割”，后者是“缝合”。(3)酶和黏性末端：不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端一定是相同的。DNA连接酶既能连接相同的黏性末端，又能连接互补的黏性末端。(4)DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口连接起来，因此DNA连接酶不需要模板。若为黏性末端，两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能通过DNA连接酶连接起来；若为平末端，则碱基相同且两条链序列相反才可用DNA连接酶连接。|探究演练|1．(2019·海淀期中)下列关于限制酶识别序列和切割位点的特点，叙述错误的是()A．所识别的序列都可以找到一条中轴线B．中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的C．能识别和切割双链DNA分子中特定的核苷酸序列D．在任何部位都能将DNA切开解析：选D所识别的序列都可以找到一条中轴线，在中轴线处切开时产生的是平末端，在中轴线两侧切开时产生的是黏性末端。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且只能在特定的位点上切割DNA分子。2．已知限制性核酸内切酶BglⅡ和BamHⅠ的识别序列和切割位点分别为AGATCT↓和GGATCC↓。下列有关叙述，不正确的是()A．这两种酶的识别序列都为6个脱氧核苷酸对B．用这两种酶切割质粒和含目的基因的DNA分子所产生的黏性末端可形成重组DNA分子C．用酶BglⅡ切出的目的基因与用酶BamHⅠ切割的质粒重组后，仍可以被这两种酶切开D．这两种限制酶都具有专一性解析：选C限制性核酸内切酶BglⅡ和BamHⅠ的识别序列和切割位点分别为A↓GATCT和G↓GATCC，而DNA分子是双链结构，说明这两种酶的识别序列都为6个脱氧核苷酸对，A正确；用这两种酶切割质粒和含目的基因的DNA分子所产生的黏性末端都是—GATC—，所以在DNA连接酶的作用下，可形成重组DNA分子，B正确；用酶BglⅡ切出的目的基因与用酶BamHⅠ切割的质粒重组后，题中所述的6个脱氧核苷酸对序列发生了改变，既不能被限制酶BglⅡ识别，也不能被BamHⅠ识别，所以不可以被这两种酶切开，C错误；所有的酶都具有专一性，D正确。探究点二|基因工程中常用的载体——质粒|核心探究|1．作用(1)作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中；(2)在受体细胞内对目的基因进行大量复制。2．本质及特点：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的小型环状双链DNA分子，它是基因工程中最常见的载体。实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上通过人工改造而成的。3．质粒作为载体所具备的条件条件分析在宿主细胞内稳定存在并能自我复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择无毒害作用避免受体细胞受到损伤4.载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞。原理如图所示：[易错易混]基因工程中载体的三点提醒(1)两种载体的不同：基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，前者的实质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞，后者是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。(2)载体需要加工：一般来说，天然载体不能同时满足所有条件，要对其进行人工改造才可以使用。(3)标记基因的筛选原理①前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。②过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，然后在培养基中加入该抗生素。③结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。|探究演练|3．下列关于质粒的叙述，正确的是()A．质粒只存在于细菌等原核生物中B．在基因工程中，被用作载体的质粒都是天然质粒C