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第15讲基因工程和细胞工程★[最新考纲]1．基因工程的诞生(Ⅰ)；2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)；3.基因工程的应用(Ⅱ)；4.蛋白质工程(Ⅰ)；5.植物的组织培养(Ⅱ)；6.动物细胞培养与体细胞克隆(Ⅱ)；7.细胞融合与单克隆抗体(Ⅱ)；8.DNA的粗提取与鉴定。精读教材——记一记1．与目的基因相关的两类“检测”(1)标记基因：检测受体细胞中是否含“重组DNA”或运载体。——在依据标记基因(如四环素抗性基因)制备的特定选择培养基(如加入了四环素的培养基)中能够生存下来的受体细胞才可能含重组DNA(目的基因＋运载体)或运载体。(2)DNA分子杂交技术(基因探针)检测转基因生物中是否含目的基因、在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素作标记，制作探针，以此与已提取到的转基因生物基因组DNA杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因已插入到受体细胞基因组中。(P14正文)2．基因工程的常考点(1)目的基因插入位置：启动子与终止子之间。(2)将目的基因导入受体细胞不发生碱基互补配对。(3)常用的受体细胞①植物：受精卵、体细胞。②动物：受精卵。③微生物：大肠杆菌、酵母菌等。(4)原核生物作为受体细胞的优点：多为单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少。3．动物细胞培养关键点(1)培养基的特有成分：动物血清。(2)培养过程：原代培养、传代培养。(3)两次使用胰蛋白酶：第一次用于制备细胞悬液，开始原代培养，第二次用于处理瓶(壁)上的细胞。4．关注植物细胞工程的几个问题(1)植物细胞A和植物细胞B杂交获得的杂种细胞有三种类型：AA型、BB型、AB型，符合要求的只有AB型，需要进行筛选。(2)杂种细胞形成的标志：新的细胞壁的生成。(3)杂种植株遗传物质的变化：杂种植株的变异类型属于染色体变异，其染色体数通常是两亲本细胞染色体数目之和，杂种植株属于异源多倍体。(4)植物组织培养时植物激素和光照的使用①植物激素的使用：脱分化阶段先使用生长素，后使用细胞分裂素，以促进细胞的分裂；再分化阶段生长素比例较高，以促进根的形成。②光照的使用：脱分化阶段不需要给予光照，再分化阶段需要给予光照，以利于叶绿素的形成。(5)利用植物组织培养生产细胞产物时，有时只需将外植体培养到愈伤组织，从愈伤组织中获取产物。5．关注制备单克隆抗体的两个常考点(1)三种细胞的特点①B淋巴细胞：能分泌抗体，不能大量增殖。②骨髓瘤细胞：能大量增殖，不能分泌抗体。③杂交瘤细胞：既能分泌抗体，又能大量增殖。(2)两次筛选目的不同①第1次：获得能分泌抗体的杂种细胞。②第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。自我诊断——判一判(1)携带链霉素抗性基因受体菌的筛选必须通过分子检测。(×)(2)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测。(×)(3)一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列。(√)(4)用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸。(×)(5)每个重组质粒至少含有一个限制性核酸内切酶识别位点。(√)(6)自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程。(×)(7)重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子中脱氧核糖和磷酸交替连接。(×)(8)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。(×)(9)动物的生长激素基因转入植物后不能表达。(×)(10)培育草莓脱毒苗所采用的主要技术是组织培养。(√)(11)去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理。(√)(12)产生抗人白细胞介素—8抗体的杂交瘤细胞的筛选必须通过分子检测。(√)(13)21三体综合征的诊断必须通过分子检测。(×)(14)乳腺细胞比乳腺癌细胞更容易进行离体培养。(×)(15)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞。(×)(16)动物杂交瘤细胞产生单克隆抗体体现了细胞的全能性。(×)(17)细胞核移植主要在同种动物、同种组织的细胞之间进行。(×)高频命题点1基因工程真题领航——目标方向导入高考1．(2019·全国Ⅰ卷，38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________。解析：本题借助基因工程的相关知识，考查考生对生物学问题进行解释的能力；通过PCR与体内DNA复制的比较，体现了科学思维中分析与推断要素。(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库；(2)体内DNA复制时，需用解旋酶打开氢键使双链DNA解旋，而PCR扩增目的基因时，是借助高温加热至90～95℃使DNA变性解旋；(3)PCR反应体系中进行互补链的合成时，温度需控制在70～75℃，则应使用耐高温的DNA聚合酶，即Taq酶，而不能使用大肠杆菌DNA聚合酶(高温下会失活)。答案：(1)基因组文库cDNA文库(2)解旋酶加热至90～95℃氢键(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活2．(2018·全国Ⅰ卷，38)回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_______________________________(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与____________________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。解析：(1)非洲爪蟾是真核生物，大肠杆菌是原核生物，将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞后能进行表达，说明该基因工程操作实验能够成功，实验成功的前提是体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达；不同物种间可以进行基因交流；(2)当受体细胞是大肠杆菌等微生物时，可以用Ca2＋处理后转化的方法进行导入；噬菌体是由噬菌体DNA和外壳蛋白组成专一性侵染细菌的病毒，不能将心肌细胞或者叶肉细胞作为宿主细胞；(3)真核生物目的基因表达时，蛋白质会被降解，所以应选择缺少蛋白酶基因的大肠杆菌作为受体细胞，因为大肠杆菌没有缺少蛋白酶，属于蛋白酶缺陷型细胞，在纯化蛋白质时也要添加蛋白酶抑制剂来避免蛋白质被降解。答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶3．(2018·全国Ⅱ卷，38)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的________中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。解析：(1)为了保证L1基因和GFP基因的完整性，应用酶E1和E4切割甲和质粒P0。(2)细胞中观察到了绿色荧光，说明L1基因完成了表达过程。(3)动物细胞核移植，应将目标细胞核移植到去核的卵母细胞中。(4)L1基因存在于核DNA上，鉴定时应取不同组织细胞中的核DNA。答案：(1)E1和E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核去核卵母细胞(4)核DNA知识拓展——培养学生文字表达能力1．(1)基因工程诞生的理论前提是什么？______________________________________________________________________________________________________________答案：①DNA是遗传物质的证明；②DNA双螺旋结构和中心法则的确立；③遗传密码的破译。(2)哪些技术发明使基因工程的实现成为可能？_____________________________________________________________________________________________________________答案：①转移载体的发现②工具酶的发现③DNA合成和测序技术的应用④DNA体外重组的实现⑤重组DNA表达实验的成功⑥PCR技术的发明⑦第一例转基因物体的问世。2．(1)为了防止目的基因自身环化，一般应如何操作？________________________________________________________________________________________________________答案：用两种不同的限制酶去切割含目的基因的DNA。(2)为了防止目的基因在质粒上反接，应怎样操作？_____________________________________________________________________________________________________________答案：对质粒和目的基因用两种限制酶切割。3．(1)将真核生物的基因直接导入原核细胞，基因能表达吗？如何才能表达？_____________________________________________________________________________________________________________答案：不能表达，只有将cDNA导入原核细胞才可能表达。(2)病毒对受体有特别要求吗？_____________________________________________________________________________________________________________答案：有。病毒为专一性侵染宿主的生物。(即病毒必须有对应的宿主细胞)核心整合——掌握必备生物知识1．基因工程常考的3种基本工具(填空)(1)限制性核酸内切酶：识别特定①核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子。(2)DNA连接酶：a.E·coliDNA连接酶只能连接②黏性末端；b.T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端。(3)载体：a.能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；b．有一个至多个限制酶切割位点，便于外源DNA片段(基因)插入其中；c．具有特殊的标记