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[学习目标]1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。2.体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程与方法。知识点一蛋白质分离的原理和方法知识梳理1.原理蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和□01、所带电荷的□02和□03，□04、吸附性质和对其他分子的亲和力等方面的差异均可用来分离不同种类的蛋白质。2．凝胶色谱法(1)概念：凝胶色谱法也称做□01，是根据□02的大小分离□03的有效方法。大小性质多少溶解度分配色谱法相对分子质量蛋白质(3)常用凝胶：□07和琼脂糖。葡聚糖(4)分离过程①分离过程示意图②分离原理相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程□08，移动速度□09，通过凝胶的时间□10；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶□11移动，路程□12，移动速度□13，通过凝胶的时间□14，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。较长较慢较长外部较短较快较短3．电泳(1)概念：是指□01在□02的作用下发生□03的过程。(2)原理带电粒子电场迁移(3)常用的电泳方法：□04和□05。①琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速率决定于□06的差异及分子的□07的不同。琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳所带电荷性质大小、形状②聚丙烯酰胺凝胶电泳：在凝胶中加入□08，使蛋白质解聚成单链，SDS与各种蛋白质形成□09复合物，SDS所带电荷较多能掩盖不同蛋白质间□10差别，使其迁移速率完全取决于□11。SDS蛋白质—SDS电荷分子的大小4．缓冲溶液(1)作用在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界□01和□02对溶液□03的影响，维持pH基本不变。(2)配制缓冲溶液通常由□04种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。酸碱pH1～21.什么是洗脱？提示：洗脱是指从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。提示2．缓冲液有何作用？为何要维持反应体系的pH不变？提示：缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH基本不变。为了在实验条件下准确地模拟生物体内的过程，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程基本相同的pH。提示3．人体血浆中存在的缓冲对有哪些？提示：NaH2PO4/Na2HPO4，H2CO3/NaHCO3。提示典题分析题型一对凝胶色谱法原理的考查[例1]相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的扩散过程，可表示为下图中()答案B答案解题分析凝胶小球体内有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，即分子量大的物质移动速度快于分子量小的物质，B正确。解析题后归纳凝胶色谱法的原理总结题型二凝胶色谱法和电泳法的比较[例2]有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是()A．它们都是分离蛋白质的重要方法B．它们的原理相同C．使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D．以上说法都正确答案A答案解题分析凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的一种有效方法；电泳法是利用待测样品中各种分子带电性质的差异和分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离或鉴定，A正确，B错误；这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，C错误。解析题后归纳凝胶色谱法与电泳法的比较知识点二血红蛋白的提取和分离实验操作知识梳理1.实验流程蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、□01和□02。纯化纯度鉴定2．实验操作(1)样品处理步骤目的过程①红细胞的洗涤去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化□01(低速短时间离心)→用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆→下层暗红色的红细胞用五倍体积的□02洗涤三次②血红蛋白的释放使红细胞破裂，释放出血红蛋白将洗涤好的红细胞倒入烧杯中→加□03至原血液的体积→加40%体积的□04→置于磁力搅拌器上充分搅拌10min分离生理盐水蒸馏水甲苯步骤目的过程③分离血红蛋白溶液经过□05使血红蛋白溶液和其他杂质分离，便于下一步对血红蛋白溶液的纯化将搅拌好的混合液转移至离心管中，以2000r/min的速度离心10min(高速长时间)→用□06过滤试管中的液体，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的血红蛋白溶液离心滤纸(2)粗分离(透析)①原理：透析袋能使□07自由进出，而将□08保留在袋内。②过程：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的□09中(pH为7.0)，透析□10h。③目的：a.除去样品中相对分子质量□11的杂质；b.用于更换样品的缓冲液。小分子大分子磷酸缓冲液12较小(3)纯化①凝胶色谱柱的制作a．取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平；b．柱底部制作：橡皮塞中间打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将上部包好；c．柱顶部制作：橡皮塞中间打孔→安装玻璃管。②凝胶色谱柱的装填③样品的加入和洗脱(纯化)(4)纯度鉴定对蛋白质纯度的鉴定，使用最多的是□20。(5)操作提示①离心除杂蛋白时，离心时转速□21，离心时间□22，一般为500r/min，离心2min，否则会使白细胞一同沉淀，达不到分离效果。洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳要低要短②商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需要直接放在□23中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入□24的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温接近至沸腾，通常只需1～2h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的□25，排除胶粒内的空气。洗脱液洗脱液微生物③在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的□26，降低分离效果。二是在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液□27，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要□28。洗脱次序流干重新装填④滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况，如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一试管，连续收集。3．结果分析与评价项目分析血液样品的处理①分层明显―→样品处理完成；②分层不明显的原因：a.洗涤次数少，未能除去血浆蛋白，b.离心速度过高或时间过长凝胶色谱柱的装填凝胶颗粒填充紧密、均匀，无气泡―→装填成功血红蛋白的分离血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出―→分离成功1.为什么选择哺乳动物红细胞作为实验材料？提示：哺乳动物的成熟的红细胞是双面凹的圆饼状，没有细胞核和细胞器。在血浆中，红细胞的含量最多，而且在红细胞的组成中，90%为血红蛋白，易提取分离。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候收集流出液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。提示2．血液的成分有哪些？提示：血液由血浆和血细胞组成，血浆中又含有水、无机盐、葡萄糖、血浆蛋白等成分，而血细胞由红细胞、白细胞、血小板构成。提示3．如何防止血液凝固？提示：在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠。提示4．如果红细胞洗涤不充分，对实验结果有何影响？提示：如果红细胞洗涤不充分，则离心后分层不明显。杂蛋白较多，不利于后续的纯化操作。提示典题分析题型三明确“血红蛋白提取与分离”中各种试剂的作用[例3]在提取和分离猪血红蛋白的实验中，应使用()A．柠檬酸钠溶液洗涤红细胞，防止红细胞破裂B．蒸馏水和甲苯处理红细胞，使其释放出血红蛋白C．生理盐水透析血红蛋白溶液，保持血红蛋白活性D．生理盐水洗脱，有利于血红蛋白在凝胶柱中移动答案B答案解题分析柠檬酸钠可与血浆中的钙离子结合，防止血液凝固，用生理盐水洗涤红细胞，可防止红细胞破裂，A错误；在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白，B正确；透析用的是磷酸缓冲液，C错误；磷酸缓冲液有利于血红蛋白在凝胶柱中移动，D错误。解析题后归纳(1)柠檬酸钠：抗凝剂，防止血液凝固。(2)甲苯：有机溶剂，可以溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。(3)生理盐水：与人体渗透压等渗，维持红细胞的正常形态。(4)蒸馏水：比人体渗透压低，能使红细胞涨破。(5)缓冲液：维持体外溶液的pH，本实验中常用的是磷酸缓冲液。磷酸缓冲液在本实验中还用于样品的洗脱。题型四DNA与蛋白质的提取与分离的比较[例4]下列关于DNA的粗提取实验和血红蛋白的提取实验，叙述正确的是()A．前者选择鸡血细胞作为实验材料较好，后者选择哺乳动物成熟的红细胞作实验材料较好B．样品预处理时，前者静置1天处理除去上清液；后者需要加入清水，反复低速短时间离心洗涤，至上清液无黄色C．在DNA粗提取实验中，往2mol/L氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时，应该缓慢加入，直到出现黏稠物即止D．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐等答案A答案解题分析DNA的粗提取实验中选择鸡血细胞作为实验材料较好，血红蛋白的提取实验中选择哺乳动物成熟的红细胞(没有细胞核和细胞器)作实验材料较好，A正确；样品预处理时，前者静置1天处理除去上清液，后者需要加入生理盐水，反复低速短时间离心洗涤，至上清液无黄色，B错误；在DNA粗提取实验中，往2mol/L氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时，应该缓慢加入，直到黏稠物不再增加即止，C错误；洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，利于后续步骤的分离纯化，D错误。解析题后归纳比较DNA与蛋白质的提取实验课堂小结当堂检测——查漏补缺巩固提升1.凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须()A．具有相同的相对分子质量B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子D．具有不同的相对分子质量答案D答案解析对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，根据其相对分子质量不同，通过凝胶色谱柱的快慢程度不同来进行分离。解析2．有关蛋白质的提取分离过程的叙述中错误的是()A．在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成C．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程D．透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内答案D答案解析透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。解析3．蛋白质的提取和分离分为哪几步()A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定答案C答案解析蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A项中SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。解析4．下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是()A．红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心B．血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌C．分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心、过滤后，用分液漏斗分离D．透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12h答案C答案解析红细胞洗涤过程中应该用生理盐水，不能用蒸馏水，A错误；血红蛋白的释放应该加入蒸馏水和甲苯，使红细胞吸水涨破，释放其中的血红蛋白，B错误；将搅拌好的混合液通过离心、过滤后，用分液漏斗分离出血红蛋白溶液，C正确；透析所用的磷酸缓冲液的pH为7.0，D错误。解析5．下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题。(1)血红蛋白是人和其他脊椎动