搜索
[学习目标]1.学会培养基的制备方法。2.掌握大肠杆菌的纯化方法。3.了解菌种保藏所用的方法。知识点一制备牛肉膏蛋白胨固体培养基知识梳理1.操作步骤2．倒平板(1)在火焰旁右手拿锥形瓶，左手□01。(2)右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过□02。(3)左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基(约10～20mL)倒入培养皿，左手立刻盖上□03。(4)待平板冷却凝固后，将平板□04放置，使皿盖在下、皿底在上。拔出棉塞火焰皿盖倒过来1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。提示2．为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？提示：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。提示典题分析题型一培养基的制备过程分析[例1]下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是()A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯C．待培养基冷却至50℃左右时倒平板D．待平板冷却凝固后将平板倒过来放置答案A答案解题分析制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，其顺序不能颠倒，A错误；牛肉膏比较黏稠，所以称好后需将称量纸一同放入烧杯中加热，当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸，B正确；待培养基冷却至50℃左右，开始倒平板，C正确；平板冷却凝固后倒置，D正确。解析知识拓展1培养基灭菌后，需冷却至50℃左右时才能倒平板，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。2整个操作在酒精灯火焰旁进行，避免周围环境中微生物的污染。3平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。知识点二纯化大肠杆菌知识梳理1.菌落的概念由一个微生物细胞繁殖而来的肉眼可见的□01，就是菌落。2．纯化大肠杆菌的原理在培养基上得到由□01细胞繁殖而来的肉眼可见的□02，即获得较纯的菌种。子细胞群体一个菌落3．微生物接种常用的方法(1)平板划线法①概念：通过接种环在琼脂固体培养基表面□01的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。连续划线②操作步骤③注意事项a．第一次划线及每次划线之前都需□09接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。第一次划线前灼烧：杀死接种环上□10的微生物。每次划线之前灼烧的目的：杀死□11，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。划线结束灼烧的目的：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染□12和感染□13。b．灼烧接种环之后，要等其□14后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。灼烧原有上次划线后接种环上残留的菌种环境操作者冷却c．在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的□15开始划线，这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。d．划线时最后一区域不要与□16相连。e．划线用力要大小适当，防止用力过大将□17划破。末端第一区域培养基(2)稀释涂布平板法①概念：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到□18的表面，进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的□19。②操作过程包括□20和□21。琼脂固体培养基菌落系列稀释涂布平板③操作步骤A．系列稀释操作步骤：a．将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。b．用移液管吸取1mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使□22充分混匀。c．从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。菌液与水注意：移液管需要经过□23。操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。B．涂布平板操作步骤：a．涂布器消毒：将□24浸在盛有□25的烧杯中消毒。b．取菌液：取少量菌液(不超过0.1mL)，滴加到培养基表面。c．涂布器灭菌：将沾有少量酒精的涂布器在□26引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。d．涂布平板：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。灭菌涂布器酒精火焰上④注意事项：a.消毒时将涂布器末端浸在盛有□27的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中□28，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。b．操作中一定要注意防火！不要将□29放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。体积分数为70%滴尽过热的涂布器4．接种成功的标准如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是□01的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，实验□02，需要分析原因，再次接种。符合要求失败5．菌种的保藏(1)目的：保持菌种的纯净，降低微生物的新陈代谢速率，延缓菌种衰老。(2)方法比较项目临时保藏甘油管藏适用范围□01的菌种□02的菌种培养基□03培养基□04培养基保藏温度4℃－20℃具体方法接种到□05上→适宜温度下培养→□06_冰箱中保藏甘油瓶中装入甘油后□07→将菌液转移至甘油瓶中→混匀后冷冻箱中保存优缺点甘油管藏法可以长时间保存菌种，临时保藏法保存时间短，菌种容易被污染或产生变异频繁使用长期保存固体斜面液体固体斜面培养基4℃灭菌1.在纯化大肠杆菌操作中，如何验证培养基灭菌是否彻底？提示：将接种后的培养基和一个未接种的培养基，都放在37℃恒温箱中培养，观察并记录结果。提示2．如果你在培养基上观察到了不同形态的菌落，你认为是由什么原因造成的？提示：培养基灭菌不彻底或接种过程中感染了杂菌。提示3．稀释倍数和划线次数是两种接种方法的关键，决定稀释倍数和划线次数的因素是什么？提示：菌液的浓度。提示典题分析题型二正确区分平板划线法和稀释涂布平板法[例2]下面四种菌落分布图中，不可能是用稀释涂布平板法得到的是()答案D答案解题分析对微生物的分离常用稀释涂布平板法和平板划线法进行接种，将不同稀释度的菌液用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这一过程是稀释涂布平板法。据图分析：A、B、C属于稀释涂布平板法接种得到的平板，D平板有明显的划线痕迹，是平板划线法接种得到的平板。解析[例3]下列关于微生物接种的描述，正确的是()A．平板划线法只用于固体培养基的接种，而稀释涂布平板法只用于液体培养基的接种B．平板划线法的操作相对简单一些C．利用平板划线法不能得到单菌落，而利用稀释涂布平板法能得到单菌落D．平板划线法所用的接种工具不需要灭菌，而稀释涂布平板法所用的接种工具需要灭菌答案B答案解题分析这两种方法都用于固体培养基的接种，都能用于形成单菌落，接种工具都要进行严格灭菌处理。解析题后归纳比较平板划线法和稀释涂布平板法的异同点题型三正确理解大肠杆菌纯化中的“多次划线”与“充分稀释”[例4]平板划线法和稀释涂布平板法是常用的两种接种方法。下列相关叙述错误的是()A．平板划线法要求在培养基表面连续划线，且除第一次划线外，每一次划线的起点都是上一次划线的末端B．除第一次划线前需要将接种环灼烧灭菌外，以后的划线可以不用灭菌即可划线C．如果菌液本来浓度不高，则可以适当降低稀释倍数D．“充分稀释”和“连续划线”的目的都是获得由单一细胞繁殖而成的菌落答案B答案解题分析在平板划线法中，连续划线的目的就是使菌种的浓度降低，所以除第一次划线外，以后的每次划线的起点都是上一次划线的末端，A正确；将接种环灼烧灭菌并冷却后沾取菌液进行第一次划线，以后的每一次划线前都要将接种环进行灼烧灭菌，B错误；稀释倍数要随菌液的浓度而定，如果菌液的浓度太大，则需要更高的稀释倍数，如果菌液本来浓度不高，就可以适当降低稀释的倍数，C正确；稀释涂布平板法中的“充分稀释”及平板划线法中的“连续划线”，目的都是获得由单一细胞繁殖而成的菌落，D正确。解析题后归纳平板划线法中的主要操作要领是“多次划线”，稀释涂布平板法中的主要操作要领是“充分稀释”，二者虽然操作方法不同，但目的是一样的，即获得由单个细胞增殖而成的菌落。如果平板划线法中的划线次数太少或稀释涂布平板法中的稀释倍数不够，则得到的可能是由多个细胞增殖而来的子细胞群体，其中还可能掺杂着其他杂菌，达不到纯化的目的。课堂小结当堂检测——查漏补缺巩固提升1．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是()A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板答案C答案解析制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，应先根据需要计算各成分用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板，C正确。解析2．纯化大肠杆菌的步骤正确的是()A．样品稀释→涂布法分离→培养成单菌落B．样品稀释→培养成单菌落→划线或涂布法分离C．样品稀释→划线或涂布→分离→培养成单菌落D．样品稀释→划线→涂布→分离→培养成单菌落答案A答案解析微生物的分离与纯化主要有平板划线法和稀释涂布平板法，其中稀释涂布平板法包括样品稀释、涂布及培养三个基本步骤，其中划线或涂布法是对微生物进行分离，培养是将分离后的菌种培养成单个菌落。解析3．现有菌液10mL，按下图进行系列稀释，在最后一个试管中测得细菌数为20个，则未稀释前的试管中有细菌()A．600个B．1200个C．2×107个D．2×106个答案C答案解析从本题的图中可看出，每次都是稀释10倍，总共稀释6次，即稀释106倍，最后一个试管为20个，即原来菌液中应该有细菌2×107个，C正确。解析4．将平板倒置的目的是()A．接种时再拿起来方便B．在皿底上标记日期等方便C．正着放置容易破碎D．防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染解析平板倒置主要是防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，D正确。解析答案D答案5．为了获得纯度高的大肠杆菌，需要对大肠杆菌进行培养和分离。培养大肠杆菌一般用牛肉膏蛋白胨固体培养基。(1)培养大肠杆菌，配制固体培养基的基本步骤：计算→称量→________→________→倒平板。(2)称量时，由于牛肉膏比较黏稠，可以用_______挑取，放在_______上称量。由于牛肉膏和蛋白胨______，称量时动作要迅速，称量后要及时盖上瓶盖。(3)在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的大肠杆菌能生长，说明培养基含有________________________等大肠杆菌生长所需的营养要素。(4)微生物纯化培养可以通过多种接种方法如______________和______________________等，使大肠杆菌在固体培养基上形成单个________，从而获得纯菌株。答案(1)溶化灭菌(2)玻璃棒称量纸容易吸潮(3)碳源、氮源、无机盐、水(4)平板划线法稀释涂布平板法菌落答案解析(1)配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的基本步骤：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。(2)称量时，牛肉膏可用玻璃棒挑取，放在称量纸上称量，由于牛肉膏和蚕白胨容易吸潮，称量时动作要迅速，防止其吸收太多水分造成误差，称量后要及时盖上瓶盖防止瓶中吸潮或被污染。(3)牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有大肠杆菌所需要的碳源、氮源、无机盐、水等营养要素，所以常用来培养大肠杆菌。(4)微生物纯化培养的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，可使大肠杆菌在固体培养基上形成单个菌落，从而获得纯菌株。解析