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研考点•重点难点探究固考基•双基体系优化目录ONTENTSC悟高考•真题演练4课时作业第十二单元生物技术实践第1讲微生物的培养与应用[考纲要求]1.微生物的分离和培养。2.某种微生物数量的测定。3.培养基对微生物的选择作用。4.微生物在其他方面的应用。一、微生物的实验室培养1．培养基2．无菌技术3．大肠杆菌的纯化培养二、分解纤维素的微生物的分离1．实验原理2．实验流程三、土壤中分解尿素的细菌的分离项目详细内容实验原理(1)能合成的细菌才能分解尿素(2)配制以为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌数量统计(1)法(显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板)(2)间接计数法：实验流程土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数脲酶尿素直接计数稀释涂布平板法1．下图是倒平板的操作，请据图填空：(1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：。(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是。(3)丁中的操作需要等待后才能进行。丙→乙→甲→丁灼烧灭菌平板冷却凝固2．据两种接种方法产生的培养效果图完成下列问题(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是、。(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是。应当怎样操作才可避免此种现象。稀释涂布平板法平板划线法菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灭菌采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灭菌考点一培养基及微生物的纯化培养技术[考点研析]一、微生物的培养基1．微生物的培养基营养要素来源功能无机碳源CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物碳源有机碳源糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等①构成细胞物质和一些代谢产物②既是碳源又是能源(有机碳源)营养要素来源功能无机氮源无机氮：NH3、铵盐、硝酸盐、N2等合成含氮的代谢产物氮源有机氮源牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物生长因子维生素、氨基酸、碱基①酶和核酸的组成成分②参与代谢过程中的酶促反应2.按物理状态分类培养基种类特点用途液体培养基不加凝固剂工业生产固体培养基加凝固剂微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏半固体培养基(如琼脂)观察微生物的运动、分类、鉴定3.按功能分类种类制备方法原理用途举例选择培养基培养基中加入某些化学物质依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计从众多微生物中分离所需的微生物加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌鉴别培养基培养基中加入某种指示剂或化学药品产生特定的颜色或其他变化鉴别不同种类的微生物用伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌4.选择培养基和鉴别培养基的应用实例类型实例选择培养基培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和酶菌等培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物石油为唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物鉴别培养基伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌(菌落呈深紫色并带金属光泽)二、消毒与灭菌条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属工具高压蒸汽灭菌法培养基及容器三、两种微生物纯化培养的方法比较项目平板划线法稀释涂布平板法关键操作接种环在固体平板培养基表面连续划线①一系列的梯度稀释；②涂布平板法操作菌体获取在具有显著的菌落特征的菌落中挑取菌体从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体优点可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数缺点不能对微生物计数操作复杂，需要涂布多个平板比较项目平板划线法稀释涂布平板法注意事项(1)接种环的灼烧①第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物②之后每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端③划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者(2)灼烧接种环之后，要冷却后再进行取种，以免温度太高杀死菌种(3)划线时最后一区域不要与第一区域相连(4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破(1)稀释操作时：每支试管及其中的9mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1cm～2cm处(2)涂布平板时①涂布器用体积分数为70%的酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精目的在培养基上形成由单个菌种繁殖而来的子细胞群体——菌落培养平板冷凝后倒置培养，使培养基表面的水分更好地挥发，防止皿盖上水珠落入培养基造成污染[命题探究]1．如表所示为某科研机构研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格内容和所学知识回答下列相关问题：成分蛋白胨蔗糖显色剂(伊红美蓝)乳糖K2HPO4琼脂含量10.0g5.0g0.2g5.0g2.0g12.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL(1)在微生物的实验室培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，因此需对培养基和培养皿进行________(填“消毒”或“灭菌”)，常用的方法是________；同时操作者的双手需要进行清洗和________。空气中的细菌可用紫外线杀灭，原因是紫外线能使蛋白质变性，还能破坏DNA的结构。(2)根据用途划分，该培养基属于________(填“选择”或“鉴别”)培养基，该培养基中的碳源是________。若要分离能分解尿素的细菌需将培养基中的蛋白胨换成__________，并用________作为指示剂。(3)培养大肠杆菌时，常用的接种方法是________和________。通过上述方法可以分离出由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，称为________。(4)检测饮用水中大肠杆菌的含量时，通常将样品进行一系列的梯度稀释，将不同稀释度的水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，然后记录菌落数量，这种方法称为________。如果经过培养后稀释倍数为102的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48(4个平板上接种的稀释液均为0.1mL)，那么每升饮用水中约含大肠杆菌________个，用这种方法测定的细菌数量比实际活菌数量要少，这是因为_______________。下列4个菌落分布图中，不可能是用该方法得到的是________。解析：(1)微生物培养中获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌污染，对培养基和培养皿需要进行灭菌处理，常用高压蒸汽灭菌法。另外，对操作者的双手常用酒精消毒处理；空气中的细菌可用紫外线杀灭，原因是紫外线能使蛋白质变性，同时还能破坏DNA的结构。(2)该培养基含有显色剂(伊红美蓝)，可使大肠杆菌菌落呈深紫色，并带有金属光泽，因此属于鉴别培养基。分析表中成分可知，该培养基中的碳源是乳糖、蔗糖，氮源是蛋白胨。若要分离能分解尿素的细菌，应以尿素为唯一氮源，因此应将蛋白胨换成尿素。若要鉴别能分解尿素的细菌，应在培养基中加入酚红指示剂。(3)常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(4)如果经过培养后稀释倍数为102的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48，则平板上平均菌落数＝(43＋47＋42＋48)÷4＝45，每毫升饮用水中约含大肠杆菌数＝(C÷V)×M＝(45÷0.1)×102＝4.5×104，每升饮用水中约含大肠杆菌数＝4.5×104×103＝4.5×107；用稀释涂布平板法测定的细菌数量比实际活菌数量要少，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落。图D中菌落分布情况为平板划线法所得。答案：(1)灭菌高压蒸汽灭菌消毒(2)鉴别蔗糖、乳糖尿素酚红(3)平板划线法稀释涂布平板法菌落(4)稀释涂布平板法4.5×107当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落D2．制备培养基方法：将蛋白胨、NaCl和牛肉膏放入烧杯内，加200mL蒸馏水，用玻璃棒搅匀后，在酒精灯上加热。当蛋白胨、牛肉膏融化后，加入琼脂，用微火继续加热至琼脂溶化，补充水至200mL。用0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液将pH调至7.0～7.2，分别对培养基和培养皿进行高压蒸汽灭菌。当培养基的温度下降到50℃时，将其分装在5套培养皿中，当培养基冷却至室温，按下表分别进行处理。将处理完毕的培养基置于35℃的温度下培养2～3天，观察每个培养基中的细菌生长情况。请回答下列问题：第1套开盖，在空气中暴露10s第2套用手指接触培养基约10s第3套用硬币接触培养基约10s第4套用滤纸擦一下课桌，再接触培养基约10s第5套对照(不打开盖)(1)该培养基中，蛋白胨提供的主要营养是_________________________，此外，培养基中还必须含有的营养物质有水和__________________________。该培养基因其中加入了琼脂而被称为___________________________，另外因含有牛肉膏、蛋白胨等成分而被称为________________________________。(2)除上述灭菌方法外，还可用__________和_____________________________方法灭菌，其中后者主要适用于金属工具。以上方法能够杀死物体内外的__________，与之相比，消毒是指使用__________方法杀死物体内外的__________。(3)在实验操作中，“当培养基的温度下降到50℃时，将其分装在5套培养皿中”的过程称为__________，“当培养基冷却至室温”后应该__________。实验中将高压蒸汽灭菌后培养基的温度下降到50℃的目的是防止_________________________。解析：(1)该培养基中，蛋白胨提供的主要营养是碳源、氮源和维生素。培养基中还必须含有的营养物质有水和无机盐。培养基因加入了琼脂而被称为固体培养基。牛肉膏、蛋白胨等成分为天然成分，含有这些成分的培养基为天然培养基。(2)常用的灭菌方法有高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌等，灭菌可以彻底杀死物体内外的全部微生物。消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体内外的部分微生物。(3)“当培养基的温度下降到50℃时，将其分装在5套培养皿中”的过程称为倒平板。“当培养基冷却至室温”后应该将平板倒置，防止冷凝水污染培养基，影响实验结果。实验中将高压蒸汽灭菌后培养基的温度下降到50℃的目的是防止培养基的温度过高使培养皿因受热不均而破裂。答案：(1)碳源、氮源和维生素无机盐固体培养基天然培养基(2)干热灭菌灼烧灭菌全部微生物较为温和的物理或化学部分微生物(3)倒平板将平板倒置培养基的温度过高使培养皿因受热不均而破裂考点二微生物的筛选与计数[考点研析]一、微生物的筛选1．微生物的鉴别方法(1)菌落特征鉴别法：根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。(2)指示剂鉴别法：如以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。(3)染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。2．筛选微生物的三种方法(1)单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。(2)选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。(3)鉴定培养法：利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。3．筛选微生物的两个实例比较比较项目土壤中分解尿素的细菌的分离分解纤维素的微生物的分离方法利用以尿素为唯一氮源的选