层析分离纯化技术策略

1蛋白层析分离纯化技术2分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括1.分子的大小和形状2.酸碱性质3.溶解度4.吸附性质5.对配体分子的特异生物学亲和力。3常用测定方法：1.根据化学组成测定最低相对分子质量2.凝胶过滤法测定相对分子质量3.聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量4.渗透压法5.沉降分析法（离心）4沉淀蛋白质的方法(1)盐析法(2)有机溶剂沉淀法(3)重金属盐沉淀法(4)加热变性沉淀法5蛋白质纯化策略融合蛋白质非融合蛋白质表达简单纯化一步亲和层析90-97%纯度更高纯度三步纯化策略粗提中度纯化精细纯化多步纯化6高效纯化策略粗提纯化精细纯化载量速度分辩率回收率7减少处理步骤得率(%)95%/步90%/步85%/步80%/步75%/步02040608010012345678步骤8准备工作考虑:纯度水平需要量保持生物活性有效和经济蛋白质特性:稳定性-pH-离子强度-温度分子量等电点9pH的重要性:蛋白质净电荷随pH改变滴定曲线蛋白质净电荷1210稳定性范围用阳离子交换用阴离子交换3pH不同pH下的分离情况21+-10pH的重要性:蛋白质净电荷随pH改变流动相的pH选择性VVV阳离子阴离子pH0+-VVVVVAbsAbsAbsAbs表面净电荷AbsAbsAbsAbs11样品准备考虑:根据蛋白质来源选择不同萃取方法使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶在室温以下快速处理用缓冲液维持pH,离子强度目的:稳定样品12三步纯化策略Step纯度粗提中度纯化精细纯化样品准备,萃取,净化达到最高纯度去除大部分杂质分离,浓缩和稳定样品13三步纯化策略步骤粗提精细纯化层析填料的颗粒大小中度纯化14三步纯化策略步骤粗提精细纯化流速中度纯化15三步纯化策略步骤粗提精细纯化分辩率中度纯化16前处理分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。17样品预处理污染物害处预防措施絮状物堵柱膜过滤、离心、匀浆脂类阻断配基、引致凝集、非特异吸附离心、如可跟目标分子兼容，可用有机溶剂核酸阻断配基、高黏度添加硫酸链霉素、硫酸精蛋白或锰盐沉淀核酸、添加核酸酶蛋白酶分解目标分子添加蛋白酶抑制剂、用亲和层析去除蛋白酶、缩短粗分时间、低温操作18粗提目的纯化粗样快速浓缩(减少体积)和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术:离子交换/疏水层析分辩率快速回收率载量19粗提:离子交换填料预装柱20ml颗粒大小流速HiPrep™16/10QXL&SPXL90µm10ml/minHiPrep16/10DEAE&CM90µm10ml/minSepharose™BigBeadsSTREAMLINE™Sepharose™FastFlow20粗提:疏水层析填料高载量高流速HiPrep™16/10Phenyl(高&低取代)HiPrep16/10ButylHiPrep16/10OctylHiTrap™HIC选择试剂盒21中度纯化目的去除大部分杂质最适用层析技术:离子交换/疏水层析HiLoad™离子交换和疏水层析预装柱分辩率快速回收率载量22中度纯化:离子交换填料Sepharose™HP34µmQ&SP150cm/hr小包装和预装柱交联琼脂醣SOURCE™30µmSepharoseHighPerformanceSOURCE30Q&S1800cm/hr聚苯乙烯/二乙烯基苯小包装23中度纯化:疏水层析填料Sepharose™HP34µm苯基300cm/hr小包装和预装柱24回收率载量精细纯化目的达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝胶过滤/离子交换/疏水层析/反相层析分辩率速度25精细纯化:凝胶过滤填料Superdex™PeptideSuperdex200Superdex75Mr3000-70000Mr100-7000Mr10000-600000分离分子量大小(球状蛋白质)102103104105106用prepgrade(34µm)放大HR预装柱(13µm)26精细纯化:离子交换填料Mono™BeadsQ&S10µm:MonoQ&S25mg上样载量3µm:MiniQ&SMini™BeadsQ&S2mg上样载量27精细纯化:离子交换和疏水层析填料RESOURCE™15µmQ,S,Phenyl,Ether,Isopropyl1ml预装柱流速高达10ml/minRESOURCEHICTestKit28精细纯化:反相层析填料Sephasil™µRPCSOURCE™RPC硅胶3µmC2/C18聚苯乙烯/二乙烯基苯120Å:肽类C4,C8,C185and12µm硅胶100Å:肽类300Å:蛋白质pH1-12(14)肽类5,15and30µm29Source™30µm15µm5µm离子交换/疏水层析/反相层析反相层析离子交换/反相层析30适用於三步纯化策略的层析技术蛋白质性质层析技术净电荷离子交换(IEX)大小凝胶过滤(GF)疏水性疏水层析(HIC),反相层析(RPC)生物辩识(配基特异性)亲和层析(AC)配基特异性，净电荷,扩张柱床吸附技术(EBA)疏水性有AC,IEXorHIC31适用於三步纯化策略的层析技术层析技术主要特色粗提中度纯化精细纯化IEX高分辨率高载量快速HIC分辨率好载量一般快速AC高分辨率高载量快速GF高分辨率RPC高分辨率32适用於三步纯化策略的层析技术层析技术样品起始状态样品结束状态IEX低离子强度高离子强度或pH改变样品体积不受限制样品被浓缩HIC高离子强度低离子强度样品被浓缩AC特异性结合特异性洗脱条件样品体积不受限制样品被浓缩GF样品体积受限制交换缓冲液(5%总柱体积)流速受限制样品被稀释RPC需要有机溶剂在有机溶剂中，或会损失生物活性样品体积不受限制33纯化工艺中不同层析技术的衔接一般准则:结合互补选择性的技术，纯化工艺应尽量采用不同层析技术(e.g.IEX,HICandGF)减少不同层析技术间的样品处理(e.g.浓缩,交换缓冲液)尽量简单34衔接层析技术时注意事项层析技术结束情况起始条件小量样品GF低离子强度IEX高离子强度或pH改变高离子强度HIC低离子强度特异性结合条件AC特异性洗脱条件样品稀释交换缓冲液(如果需要)35合理衔接不同层析技术低溶解度的蛋白质SDS萃取SDS萃取溶解试剂(尿素,乙二醇非离子性清洁剂)GF(在非离子性清洁剂中)HICHICGFGF36合理衔接不同层析技术粗样或样品含高盐GF脱盐GF脱盐GF脱盐ACIEXHIC或者需要稀释IEXIEXHICGF或RPCGF或RPCGFGF样品澄清粗提中度纯化精细纯化37合理衔接不同层析技术样品非常澄清或很稀ACIEXIEX沉淀(e.g.在高离子强度下)HIC重新溶解GF作含高盐样品处理粗提中度纯化精细纯化GF或RPCGF或RPC38一种不稳定，氧气敏感酶的纯化，结晶和三维结构测定Purificationofalabile,oxygen-sensitiveenzymeforcrystallizationand3Dstructuredetermination一个可溶性，非融合蛋白质的多维纯化去乙酰氧化头孢菌素C合成酶DeacetoxycephalosporinCsynthase(DAOCS)RamaBhikhabhaiandHelenaHedlund,AmershamPharmaciaBiotech联合合作MatthewLloydandChristopherSchofield,OxfordCentreforMolecularSciences,Oxford,UKIngerAndersson,SwedishUniversityofAgriculturalSciences,Uppsala,Sweden39DAOCS去乙酰氧化头孢菌素C合成酶D-AA=d-(D-a-aminoadipoyl)主要参与在头孢菌素和来自链丝菌clavuligerus中青霉素N的头霉菌素的生物合成属于非红血素类亚铁依赖性的氧化酶青霉素NSNCOOHOD-AANHOD-AANHNSCOOHDAOCSRingexpansion去乙酰氧化头孢菌素C40DAOCS-纯化策略纯化目标DAOCS·定性准备样品精细纯化粗提快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)中度纯化快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)41DAOCS-纯化目标得到5-10mgDAOCS，纯度足够进行结晶和X-射线绕射分析在一个工作天内完成整个纯化流程工艺可放大最少10倍.42结晶纯需要大分子均一性-其他,污染性蛋白质序列均一性-蛋白水解片段-转译后修饰-其他修饰(氧化等)构象均一性-聚合-失活要拿到高纯度结晶，必须使用纯和均匀的蛋白质43DAOCS-定性参数等电点分子量盐稳定性一般稳定性对纯化设计的影响在粗提时使用中性pH进行阴离子交换层析用Superdex™75prepgrade凝胶过滤技术进行精细纯化可以使用疏水层析在缓冲液中加DTT工艺设计重点缩短整体纯化时间数值4.8345002M(NH4)2SO4容易氧化44DAOCS-一般准则在所有缓冲液中加DTT使所有半胱氨酸残基保持还原状态加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性用SDSPAGE检查每一个组份中DAOCS利用酶测定法测量生物活性45准备样品悬浮细菌细胞在溶解缓冲液中超声震荡破碎细胞DNA沉淀利用离心沉淀来源:从S.Clavuligerus克隆得到的DAOCS基因和在大肠杆菌的胞浆中扩增46选择粗提的层析技术阴离子交换:快速,浓缩样品处理最简单分离基础:电荷因为DACOS的酸性pI和不稳定性，所以缓冲液选择中性pH47粗提-在ÄKTA™FPLC上优化梯度线性梯度步级梯度优化梯度层析柱:HiPrep™16/10QXL系统:ÄKTAFPLC0102030min01002003001002003004000020406080mAUmlmS/cm01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min48选择中度纯化技术HIC:分离基础:疏水性蛋白质疏水性质很难预测:筛选适合填料HIC可以跟IEX互补衔接,减少样品处理步骤(只需要加盐)DAOCS在高盐下能保持稳定49选择精细纯化的层析技术GF:分离基础:分子量差异GF:最适合分离双体，寡聚体和聚合物50DAOCS-优化好的粗提步骤层析柱:HiPrep™16/10QXL系统:ÄKTA™FPLC•浓缩样品•快速去除有害物质01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm51DAOCS-优化好的中度纯化步骤层析柱:SOURCE™15ISO内径16mm,长度50mm系统:ÄKTA™FPLC•HIC和IEX互补•浓缩样品•除去大部分杂质01002001002003004000mlA280nm52DAOCS-优化好的精细纯化步骤层析柱:HiLoad™16/60Superdex™75prepgrade系统:ÄKTA™FPLC•去除聚合物和余下的少量污染物•交换缓冲液08060402010020040060080010000mlmAU53DAOCS-用SDS-PAGE分析4321MMM-LMW低分子量标记1-样品2-组份-QSepharose™XL3-组份-SOURCE™15ISO4-组份-Superdex™75pg67k43k30k54DAOCS纯化-结果粗提中度纯化精细纯化08060402010020040060080010000mlmAU0100200100020003