改变生活的生物技术-细胞工厂

1改变生活的生物技术世界上昀小的工厂-细胞工厂2世界上昀小的工厂-细胞工厂•什么是细胞工厂•微生物细胞工厂•基因工程•基因工程改造后的微生物细胞工厂•高等生物细胞工厂•细胞工厂的升级版3世界上昀小的工厂-细胞工厂•什么是细胞工厂•微生物细胞工厂•基因工程•基因工程改造后的微生物细胞工厂•高等生物细胞工厂•细胞工厂的升级版4什么是工厂?世界上昀大的工厂•工厂是一类制造产品的建筑。•世界上昀大的工厂是波音公司的飞机组装厂，其体积超过了1千300多万立方米。工业革命时期的工厂5世界上昀小的工厂昀小的工厂•昀小的工厂的长度不到2个微米，1个针眼里可以排上几千这样的工厂。•昀小的工厂是细胞。6细胞和工厂=产品原料产品养分废物新陈代谢•工厂从外界获取原料，将其转化为产品后再输送回外界。•细胞进行新陈代谢，吸收养分，排除废物。有时废物是对人类用用的产品7细胞工厂的概念•细胞工厂是以单细胞，或者简单的多细胞生物为基本单位进行生产的工厂。8细胞的内部构造与工厂相似细胞膜高尔基体核糖体---------围墙动力部门线粒体----生产机器----控制室细胞核----转运部门---细胞工厂的产品是蛋白质和代谢产物9细胞工厂的优势：自我复制……•细胞可以自我复制，这是生命体的基本特征。•假设一个细胞的复制周期为1个小时，81个小时后，细胞的总体积就会超过波音公司的飞机组装厂。•自我复制使细胞工厂能够以群体的方式进行大规模的生产。细胞10细胞工厂的优势：生产速度快•酵母细胞生产速度：9个氨基酸/秒。•全自动多肽合成仪：一个氨基酸/分种。•细胞能够高速合成的关键是采用了酶来催化反应。•自然进化VS人类科技多肽链酵母细胞1秒钟1分钟多肽合成仪11细胞工厂的优势：生产独特的产品•代谢产物是细胞在新陈代谢过程产生的非蛋白类的有机小分子。•许多代谢产物是重要的产品，但很难或者无法用化学方法来合成。抗生素紫杉醇柠檬酸12微生物细胞工厂•微生物(microorganism)，是指个体微小、不能被肉眼观察到的生物。•绝大多数微生物是单细胞或者简单多细胞的生物，因此微生物是天然的细胞工厂。大肠杆菌酵母霉菌病毒原生动物13高等生物细胞工厂高等生物细胞工厂哺乳动物单细胞体外培养昆虫植物细胞工厂与发酵14传统发酵传统发酵微生物细胞工厂现代发酵现代发酵高等生物细胞工厂传统发酵现代发酵生物微生物微生物，植物细胞昆虫细胞，哺乳动物细胞产品天然代谢产物，菌体天然代谢产物，菌体异质化合物（包括外源蛋白）15世界上昀小的工厂-细胞工厂•什么是细胞工厂•微生物细胞工厂•基因工程•基因工程改造后的微生物细胞工厂•高等生物细胞工厂•细胞工厂的升级版16知其然•人类在大约公元6000年前开始运用发酵技术来制造许多重要的日常食物。•发酵的本质是利用微生物将原料中的分子进行分解和转化。微生物发酵17知其所以然LeeuwenhoekLouisPasteur•1676年，荷兰商人Leeuwenhoek用显微镜发现了微生物。•1875年，法国科学家LouisPasteur证明了发酵是由微生物引起的，而且不同的微生物可以产生不同的发酵产物。•Pasteur的发现推动了微生物细胞工厂的工业化生产。18微生物细胞工厂的发展•19世纪之前，微生物细胞工厂用于食物的改造。•进入20世纪，微生物细胞工厂生产甘油、柠檬酸、乳酸和丙酮等工业原料。•20世纪30年代，微生物细胞工厂生产了一种重要的产品-维生素C。•20世纪40年代，诞生了微生物细胞工厂昀重要的产品之一-青霉素。19世界上昀小的工厂-细胞工厂•什么是细胞工厂•微生物细胞工厂微生物细胞工厂介绍之一：青霉素微生物细胞工厂介绍之二：维生素C•基因工程•基因工程改造后的微生物细胞工厂•高等生物细胞工厂•细胞工厂的升级版20贵比黄金的青霉素是怎么变得和水一样便宜的？微生物细胞工厂介绍之一21•1928年，苏格兰生物学家AlexanderFleming在青霉菌的分泌物中发现了青霉素。青霉素的发现AlexanderFleming细菌无法在青霉周围生长22•1938年，澳大利亚的病理学家HowardFlorey与英国生化学家ErnstBorisChain等人合作，证明了青霉素对于细菌感染具有很强的疗效。•1945年，Flemming,Florey和Chain分享了诺贝尔生理学奖。青霉素在治疗中的应用ErnstBorisChainHowardFlorey青霉素的结构23青霉素的合成途径氨基己二酸半胱氨酸缬氨酸ACV合成酶ACV三肽异青霉素异青霉素合成酶脂酰辅酶A:异青霉素酰基转移酶青霉素生物合成效率远高于化学合成。24早期青霉素的产量极低Florey实验室用于培养青霉素的罐子Chain在纯化青霉素•早期青霉素的产量极低，第一位患者由于剂量不足而死亡。•1942年3月，美国利用青霉素成功治愈了第一位患者，但用去全美青霉素产量的一半。25提高青霉素产量的关键点青霉青霉素？•提高微生物产量的两大关键：优化菌株（内因）优化培养条件和生产工艺（外因）26青霉素培养条件和生产工艺的优化AndrewJ.Moyer美国北部地区研究所玉米田•1941年，Florey和Heatly与美国北部研究所的Moyer合作进行青霉素的发酵研究。•工艺优化：添加玉米浸出液，乳糖替换葡萄糖，将青霉素的产量提高了10倍。•专利之争。27青霉素高产菌株的发现•1943之前，生产菌株源自Flemming的青霉菌株。•1943年，科学家发现Penicilliumchrysogenum。该菌株的青霉素产量比Flemming的菌株高上百倍。•进一步的诱变，使青霉素产量提高了750倍。Flamming发现的青霉菌株Penicilliumnotatum青霉素高产菌株Penicilliumchrysogenum28战争的需求推动了产量提高•二战的进行使得国家对于青霉素的需求极为迫切。各大药物公司全力以赴生产青霉素。•规模扩大：从1升培养瓶（1%产率）到38吨发酵罐（80-90%产率）•产量蹿升：1942年6月，10人剂量。1943年5月，400人的剂量。1944年6月，230万人剂量。•产量的上升伴随着价格的下降：1942年无价，1943年20美元/人剂量，1946年55美分/人剂量….5元人民币/人剂量29青霉素的重大意义•青霉素使得二战中盟军的死亡率减少了12-15%。自青霉素问世以来，挽救了至少6000万人的生命。•对于青霉素的深入研究，开启了对于其他抗生素的发掘和使用。•青霉素的生产为现代发酵技术提供了标准化的流程，推动了微生物产业的的发展。30青霉素的生产流程31青霉素的生产流程32青霉素的生产流程33培养基•培养基：提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。•培养基的设计要兼顾微生物的特点，科研和生产的需求，以及经济效益。34培养基的组成必须要素•碳源•氮源•能源•无机盐和微量元素•生长因子•水补充要素•前体•抑制剂和促进剂35培养基的组成必须要素•碳源•氮源•能源•无机盐和微量元素•生长因子•水补充要素•前体•抑制剂和促进剂36能源•光能是自养微生物的能源。例如蓝细菌和藻类。•氢、硫、氨、亚硝酸盐、亚铁盐等无机盐是化能自养微生物的能源，例如硫细菌。•碳水化合物等有机物、石油、天然气及石油化工产品是异养微生物的能源。蓝细菌硫杆菌大肠杆菌酵母青霉菌37生长因子•生长因子是微生物生长不可缺少，但不能用简单的碳、氮源自行合成的的微量有机物。包括维生素，碱基，甾醇，脂肪酸，氨基酸等。生物素(Biotin)是一种经常需要补充的生长因子。生物素又称维生素B7，是羧化酶的辅酶,参与脂肪、氨基酸和糖类合成，与细胞膜通透性相关。生长因子•生长因子的天然来源玉米浆（玉米浸出液）,0.4-0.8%麸皮水解液,1%糖蜜,0.1-0.4%酵母提取物前体•某些化合物被加到培养基后，能够直接在生物合成过程中结合到产物分子中去，从而提高产品的产量。这类小分子物质称为前体。产物前体产物前体青霉素G苯乙酸，苯乙酸胺维生素B12钴化物链霉素肌醇，甲硫氨酸，精氨酸胡萝卜素b-紫罗兰酮金霉素氯化物L-丝氨酸甘氨酸红霉素丙酸，丙醇，丙酸盐，乙酸盐L-异亮氨酸苏氨酸40青霉素的合成途径氨基己二酸半胱氨酸缬氨酸ACV合成酶ACV三肽异青霉素异青霉素合成酶脂酰辅酶A:异青霉素酰基转移酶青霉素前体青霉素异青霉素苯乙酸促进剂和抑制剂一类刺激因子，他们并不是前体或营养，其加入可以影响微生物的正常代谢，或促进中间代谢产物的积累，或提高次级代谢产物的产量。促进剂•诱导物(如IPTG)•表面活性剂•EDTA•大豆油抽提物常见促进剂会抑制某些代谢途径的物质，通常伴随着对其他代谢途径的激活，从而改变微生物的代谢途径。抑制剂产物被抑制的产物抑制剂链霉素甘露糖链霉素甘露聚糖43青霉菌的培养基•青霉菌以乳糖为碳源，能生产更多的青霉素。•玉米浸出液是玉米加工的副产品，为青霉菌提供了优质的氮源、前体（苯乙酸）和生长因子（生物素）。玉米浸出液氮源+无机盐乳糖和葡萄糖碳源•青霉素通过感受葡萄糖的浓度来调节青霉素的产量，在保障能量的合理利用的前提下，杀死竞争对手。44青霉菌青霉素葡萄糖其他细菌葡萄糖抑制青霉素的生成•乳糖不抑制青霉素的合成，青霉菌在没有葡萄糖的条件下，大量产生青霉素。45青霉菌青霉素乳糖X其他细菌产品乳糖不抑制青霉素生成•目前可根据青霉菌的形态变化，滴加葡萄糖，取代乳糖。•普遍采用水解淀粉的方式来获得葡萄糖，流加葡萄糖化液，降低成本。46青霉菌青霉素控制葡萄糖加入量来促进青霉素生成葡萄糖47青霉素的生产流程48培养基需要灭菌后使用•培养基灭菌的原理：利用高压和热杀死培养基中的所有生命体。•青霉菌是培养基中唯一的生物，可以在不受其他生物干扰的情况下生长。大型灭菌器高压锅49青霉素的生产流程50种子液•微生物的生长分为延滞期，指数期，稳定期和衰亡期。•微生物在延滞期中，代谢系统需要适应新环境，细胞数目没有增长。•微生物会分泌一些物质来促进自身的生长。如果起始培养基中微生物浓度过低，会导致促生长物质的浓度很低，延滞期过长。51种子液•先将微生物在少量培养基（种子液）中生长，提高接种量，保持培养液中促生长物质的浓度，从而缩短延滞期的时间，使细胞快速进入对数生长期。待微生物生长到对数生长期后期后，转移到二级发酵罐中生长，接种量一般为5~20%。•待到二级发酵罐中微生物生长到对数生长期后期后，转移到三级发酵罐中生长。用这种接力的方式来进行接种，可以明显缩短培养周期。52青霉素的生产流程53发酵•青霉菌在发酵罐中生产青霉素。•发酵罐要对温度、压力、pH、补料、铁离子进行实时监控。发酵罐54青霉素的生产流程55过滤菌体•在生长过程中，青霉将青霉素释放到培养液中。•在发酵完成后，为了提纯青霉素，首先要将菌体去除，常用的方式是过滤。旋转真空过滤器56青霉素的生产流程57有机溶剂萃取青霉素•青霉素在酸性条件下容易溶解于有机溶剂。•将培养液的pH调至酸性，采用醋酸丁酯和戊酯等溶剂进行萃取。乙酸戊酯58青霉素的生产流程59离心收集青霉素•采用离心的方式，将含有青霉素的有机溶剂与水溶液区分开碟式离心机60青霉素的生产流程61提纯青霉素•利用水溶液和有机溶剂对青霉素进行进一步萃取。•获得溶解在有机溶剂中的高纯度的青霉素•将溶液调节至碱性后，青霉素晶体析出，用离心机将晶体分离出来。大型纯化设备篮式离心机62青霉素的生产流程63青霉素干燥•结晶获得的青霉素中含有大量水分。•在大型的干燥器中，利用热空气将青霉素吹起，去除其中的水分。•昀后获得白色干燥的青霉素粉末。大型干燥器青霉素被风吹起干燥的青霉素粉末64世界上昀小的工厂-细胞工厂•什么是细胞工厂•微生物细胞工厂微生物细胞工厂介绍之一：青霉素微生物细胞工厂介绍之二：维生素C•基因工程•基因工程改造后的微生物细胞工厂•高等生物细胞工厂•细胞工厂的升级版65维生素C-新鲜蔬果中的神奇小分子微生物细胞工厂介绍之二66维生素C是人类的必须营养素•人类是少数几种自身无法合成维生素C的动物，新鲜的蔬菜水果和生肉中含