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SZBC核酸实验室污染原因分析及污染控制对策深圳市血液中心检验科曾劲峰SZBC行政主管部门颁布文件《临床基因扩增实验室管理暂行办法》《医疗机构临床扩增实验室管理办法》《血站核酸检测实验室质量保证指南》血站核酸检测(NAT)实验室是具有特殊安全要求的工作场所极微量的污染即可导致假阳性结果保障血液安全（输血安全）保护献血资源（献血安全）SZBC为何要高度重视核酸实验室环境污染并制订应对策略PCR核酸检测技术（nucleicacidamplificationtesting,NAT）包括两种扩增方式：1.聚合酶链锁反应法（Polymerasechainreaction，PCR)2.转录介导的扩增方法(transcriptionmediatedamplification,TMA)核酸检测技术TMA目前核酸检测（NAT）已经在输血安全血液筛查方面发挥着越来越大的作用。但是由于其敏感性极高,微量的污染将造成实验失败.全国40余家检测数量300万人份SZBC目录影响NAT实验室污染原因1实验室污染的判断和预防2核酸实验室污染的消除3核酸实验室污染的监控及对策4SZBC影响NAT实验室污染原因一核酸实验室设备污染标本阳性率异常增高阴性对照出现阳性其他污染产物污染试剂污染标本污染SZBC核酸实验室污染原因一标本容器被污染标本放置时,由于密封不严溢于容器外标本核酸模板在提取过程中，由于操作导致标本间污染在进行标本处理时，病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染标本污染试剂污染试剂处理配制过程中移液器容器实验用水或储存不当SZBC核酸实验室污染原因一产物污染-最主要最常见极微量的扩增产物污染,就可形成假阳性。（产物来源可能来源于设备内部，或实验室外部实验活动产生的污染）。产物污染其他污染实验室中克隆质粒的污染分子生物学实验室及用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见克隆质粒在单位容积内含量浓度高其污染可能性也很大SZBC核酸实验室污染的判断和预防二阳性标本数量异常增高v渐进式(假阳性日益增多）v散发式（假阳性样品不定期增多）v突发式(假阳性样品突然增多)阴性对照出现阳性反应实验室污染的表现形式SZBC核酸实验室污染的判断和预防二定期统计实验室阳性数量SZBC核酸实验室污染的判断和预防二可能存在的污染情况试剂污染(更换新的试剂重新检测评估)标本污染(重新采样进行检测,评估标本前处理环节)设备污染(设备整体消毒清洁\维护)产物污染（全面清洁消毒实验室、仪器设备所有实验有关用品）针对可能发生的污染情况有的放矢SZBC核酸实验室污染的判断和预防二合理的核酸实验室分区合格的实验操作人员合适的检测试剂和检测平台严谨、科学的质量管理体系完善的实验室环境监控措施SZBC完备的实验室配套设施•血筛核酸实验室仪器设备特点：高自动化高检测通量高信息化提供良好条件预防实验室的污染严格的管理---可操作性的SOP•严格控制进出实验室的人员。严格执行《核酸实验室设置与管理规范》的管理；•尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性；•核酸实验室医疗废物按《医疗废物管理程序》执行。废液不能在实验室中倾倒。•扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。SZBC将样品和标准品、对照品去掉盖子，按照工作列表插入样品架避免交叉污染；实验中须使用一次性手套，手套在实验过程中疑有污染应立即更换，每个区的物品均有明确标示，各室物品不得混用。避免因不能戴上手套而用手反复搓揉手套或用口吹胀手套的行为；实验人员经过全国血液病毒核酸检测培训班培训并取得上岗证；每天清洁一遍工作台面，每月彻底维护清洁一遍检测系统（包括分析仪，电脑）；规范的预防措施SZBC核酸实验室污染的判断和预防二预防为主，严守规程SZBCSZBC细致的工作流程正确的上样方式。正确的试剂装载方式正确的仪器设备维护方式正确的医疗废物处理方式规范的预防措施SZBCSZBC封闭的实验环境方便快捷的试剂装载试剂分配区、样本分配区相互隔离扩增反应管的密封性能实验废弃物收集区相对隔离查找可疑污染源1)回顾检查试剂的存放和使用过程2)设备有无存在污染物外泄。3)排查是否为扩增产物污染4）评估标本是否处理不当5)环境是否受到外来性的污染。1）更换新的试剂2）到其他核酸实验室验证试剂是否污染3）更换核酸实验室所有耗材：记号笔，记录本，甚至拖把等等1）实验台面、超净工作台用现配的3%双氧水或次氯酸钠溶液擦拭清洁2）用10%漂白粉溶液擦拭3）紫外光照射，照射距离应不超过90cm，照射时间最好过夜4）通风更换试剂、耗材清洁所有可能污染源核酸实验室污染的消除三研究证明，紫外线照射、84消毒液是清除实验室外源性DNA污染的有效方法；过氧乙酸消毒液、次氯酸钠溶液和戊二醛消毒液。SZBC经过空气下落法取样追踪实验，结果是阳性，推断污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的。若所有处理后连续三次仍为阳性——更换实验场所核酸检测1)空气下落法取样在每个取样点放置3个样品管，每管4ml生理盐水暴露放置1h后，进行核酸检测2)物体表面擦拭法取样用5cm×5cm标准涂擦法，用浸有生理盐水的棉拭子按照上述标准横竖往返均匀涂擦5次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子放入无菌的4ml生理盐水试管内浸泡30min后弃棉拭子，对棉拭子浸泡液进行核酸检测SZBC•标本污染实验室台面后，用纸巾初步清洁台面，然后用84消毒原液清洗，用去离子水清洁。•使用75%的酒精清洁污染处。•停止使用被污染的工作台，按《可移动紫外线灯标准操作规程》进行紫外消毒。•每天0.5％84消毒液清洁地面。标本污染的紧急处理SZBC•清洁实验室墙面、地面、工作台面。•对空气用紫外灯进行消毒•清理工作台面多余的物品（如文件盒、文具、各种与实验无关的物品）。•检查更换空调滤网、对空调、天花板进行清洁消毒。•检查各实验室间的空气流通是否独立。•定期（每周一次）消毒离心机、离心杯、上样试管架。实验室环境污染的处理SZBC核酸实验室污染的监控及对策四对照质控成功可重复性血液筛查核酸实验室每月至少实施暴露表面有无核酸扩增产物污染的监测设备表面工作台面辅助设备（手推车、试剂摇摆移等）SZBC污染清除后的确认对一定数量的个阴性标本或盐水（＞90个）进行检测，结果均为阴性SZBC试管架的浸泡消毒SZBCSZBCSZBCSZBC好的核酸实验室，要时刻注意污染的监测并制订有效的防范机制有无污染？什么原因造成的污染？采取什么措施，防止和消除污染？实验室污染的监控SZBC•设立阴、阳性对照，即可验证核酸检测的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性•选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品•如果扩增结果中试剂阴性对照为阳性反应，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。设立阴阳性对照定期监控室内环境•空气下落法取样•物体表面擦拭法取样SZBC定期监控室内环境•空气下落法取样•物体表面擦拭法取样对容易造成污染的工作面进行定期监控，建议1次/月门把手离心机摆放台面离心机开盖处样本处理区试剂试剂操作工作台报告发放区SZBC定期对仪器设备的运行环境进行监控•清洁设备表面对仪器设备的辅助用品定期消毒定期清洁消毒离心机、离心杯试管架SZBC采集时间采集人环境采样检测信息检测时间检测人序号采集位置检测结果（NAT）1核酸I室门把手阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/2核酸I室(RPI)设备I台面阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/3核酸Ⅰ室(RPI)设备Ⅱ台面阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/4核酸Ⅱ室离心机摆放台面阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/5核酸室Ⅱ工作台面I阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/6核酸Ⅱ室工作台面Ⅱ阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/7核酸检测室(Ⅲ室)报告发放区阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/8核酸检测室(Ⅲ室)工作台面I阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/9核酸检测室(Ⅲ室)工作台面Ⅱ阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/101363Tigris样品放置区把手阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/111631Tigris样品放置区把手阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/12盐水对照管阴性/阳性/1/3，2/3，3/3/监控结果：科主任：日期：核酸实验室环境监控记录表备注：取样方法1、取干净真空分离胶采血管，装入新开瓶的5ml生理盐水并将其编上“序号”。2、取干净棉签在相应位置擦拭取样后放入装有生理盐水的试管内，放置5分钟SZBC•室内质量控制在使用试剂方面要做到4个必须1）必须保证使用试剂中有内标的存在;2）必须保证试剂存放符合要求，防止污染导致假阳性的出现;3）必须采用阴性对照，以判断核酸实验室是否遭受污染4）必须每个检测批次都应有阳性对照，且阳性对照的浓度不宜过高，约为仪器检测下限3-5倍左右，以监测核酸提取的有效性5）卫生部临床检验中心组织的全国血站核酸扩增检测项目的室间质量评价•如果实验室同时运行1个以上的独立的核酸检测系统，则需分别参加室间质量评价做好室内质量控制和室间质量评价SZBC认真细致精益求精防微杜渐SZBC