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05DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离课标解读知识目标1．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理2．理解缓冲液的组成作用和机理能力目标体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法情感态度与价值观通过血红蛋白的提取和分离实验，使学生明确科学实验需要严肃、认真和实事求是的态度课前导学1．凝胶色谱法也称做__________，是根据______________分离蛋白质的有效方法。大多数凝胶是由__________构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，________________的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程______，移动速度________；而____________的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在__________移动，路程________，移动速度________。样品中的____________的蛋白质先流出，____________的蛋白质后流出。因此，相对分子质量不同的蛋白质得以分离。2．在一定范围内，缓冲溶液能抵制__________对溶液______的影响，维持pH基本不变。3．电泳是指带电粒子在________的作用下发生______的过程。其原理是许多重要的生物大分子，如__________、________等都具有__________的基团，在一定pH下，这些基团会带上________或________。在电场的作用下，这些带电分子会向着______________移动。4．蛋白质的提取和分离一般分为四步：____________、________、________和____________。5．将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加__________到原血液的体积，再加40%体积的________，置于____________上充分搅拌10min。将搅拌好的混合液离心后可观察到试管中溶液分为4层：第1层：的甲苯层第2层：的沉淀层——薄层固体第3层：的水溶液——透明第4层：其他杂质的色沉淀物6．样品的加入和洗脱(1)加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的________下降到与__________平齐，关闭出口。(2)加样：用________小心地将1mL________的样品加到色谱柱的________。(3)加样后：打开__________，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入后，关闭下端出口。小心加入缓冲液到__________，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每________收集一管，连续收集。答案1．分配色谱法相对分子质量的大小多糖类化合物相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快相对分子质量较大相对分子质量较小2．外界酸和碱pH3．电场迁移多肽核酸可解离正电负电与其所带电荷相反的电极4．样品处理粗分离纯化纯度鉴定5．蒸馏水甲苯磁力搅拌器无色透明脂溶性物质白色血红蛋白红色暗红6．缓冲液缓慢凝胶面吸管透析后顶端下端出口适当高度5mL知识点解读知识点一凝胶色谱法1．原理相对分子质量直径大小运动方式运动速度运动路程洗脱次序大大于凝胶颗粒空隙直径，被排阻在外面垂直向下移动较快较短先从凝胶柱洗脱出来小小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部垂直向下移动，无规则扩散进入凝胶颗粒较慢较长后从凝胶柱洗脱出来2.凝胶色谱柱的组成凝胶色谱柱由容积柱、多孔板和凝胶颗粒介质组成。多孔板的网孔大小，决定了分离的蛋白质的相对分子质量范围，常用介质是交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等。其装置如下图。【例1】凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须()A．具有相同的相对分子质量B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子D．具有相对分子质量不同的蛋白质【解析】对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的。分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同的多种成分在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，从而将各种成分分开，在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。【答案】C知识点二缓冲溶液1．缓冲液的作用在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外的pH与体内基本一致。这种环境需要缓冲溶液的维持。2．缓冲溶液的组合缓冲溶液必须同时含有两种物质。一种是能抵制外加少量强碱的物质，另一种是能抵制外加少量强酸的物质。3．缓冲剂的组合类型(1)弱酸和弱酸强碱盐组合：H2CO3NaHCO3、CH3COOHCH3COONa。(2)弱碱和弱碱强酸盐组合：NH4OHNH4Cl。(3)多元弱酸的酸式盐和它所对应的次级盐：NaH2PO4Na2HPO4、KH2PO4K2HPO4。生物体内的缓冲物质通常是由H2CO3NaHCO3、NaH2PO4Na2HPO4组成。【例2】在分离蛋白质过程中，使用缓冲液的作用是()A．维持溶液浓度不变B．维持溶液酸碱度不变C．催化蛋白质分离过程顺利完成D．无实际意义【解析】分离蛋白质要用缓冲液，原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变，并非无实际意义或其他。【答案】B知识点三电泳1．定义电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。2．电泳分离物质的原理电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种组分的分离。3．常见的电泳方法常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。(1)琼脂糖凝胶电泳目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳；②琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98%～99%)，近似自由电泳，样品扩散较自由，电流对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；③琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定；④电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离，具有电泳和分子筛的作用。其优点如下：①聚丙烯酰胺凝胶没有或很少带有离子的侧基，因而电泳作用比较小，不易和样品相互作用；②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化。可以根据需分离物质的分子大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性能；③在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定；④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。【例3】下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因()A．带电性质差异B．分子的大小C．分子的形状D．分子的变性温度【解析】电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子变性温度无关，因此选D。【答案】D知识点四血红蛋白的提取与分离1．样品处理(1)红细胞的洗涤①过程：a.采集血样→b.低速短时间离心→c.吸出血浆→d.盐水洗涤→e.低速离心→f.重复d、e三次。②目的：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。③注意事项a．离心时转速要低，时间要短，一般为500r/min，离心2min。b．洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数。(2)血红蛋白的释放①过程：②目的：使红细胞涨破，血红蛋白释放出来。(3)分离血红蛋白溶液①过程：将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min。②目的：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。③结果溶液分为4层第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）2．粗分离—透析取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h，目的是除去样品中分子量较小的杂质。3．纯化—凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作①取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需要用砂纸磨平；②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目的尼龙纱布包好；③顶塞制作：打孔→安装玻璃管；④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体；⑤安装其他附属结构。(2)凝胶色谱柱的装填(本实验使用交联葡聚糖凝胶)①固定：将色谱柱垂直固定在支架上↓②装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内↓③洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h(3)样品的加入和洗脱①调整：缓冲液面与凝胶面平齐↓②滴加透析样品：用量为1mL↓③样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层↓④洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱↓⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL一试管，连续收集【例4】以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确．．．的是()A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢【解析】哺乳动物成熟红细胞没有细胞器和细胞核，在提取蛋白质时杂质较少。洗涤红细胞时用等渗的生理盐水可以防止细胞破裂。利用相对分子量不同在凝胶色谱柱中移动的速度不同可以分离相对分子量不同的物质，分子量越大的蛋白质在色谱柱中移动的路程短、速度快。在色谱分离过程中可以用血红蛋白特有的红色监测蛋白质的分离过程。【答案】D【例5】红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：(1)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。①加入柠檬酸钠的目的是_________________________________。②以上所述的过程即是样品处理，它包括__________、________、收集血红蛋白溶液。(2)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。①透析的目的是________________________________________________________。②透析的原理是_______________________________________________________。(3)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。①样品纯化的目的是________________________________________________________________________。②血红蛋白有什么特点？________________________________________________________________________。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？_______________________________________________________________________________________