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05DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应圹增DNA片段课标解读知识目标1．知道细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件；知道DNA合成的方向2．理解PCR的原理，掌握PCR的基本步骤及每个步骤前发生的变化能力目标体验PCR这一常规的分子生物学实验方法情感态度与价值观培养对先进生物学技术的兴趣课前导学1．体外参与DNA复制的各种组成成分有__________、________、__________、____________、________。2．DNA的两条链是__________的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(—OH)末端称为__________，而磷酸基团的末端称为________。3．DNA复制需要______。当________与DNA母链通过____________结合后，DNA聚合酶就能从__________开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的__________向______延伸。4．__________是进行DNA复制的前提，在__________的温度范围内，DNA的________将解体，双链分开，这个过程称为________。当温度________后，两条彼此分离的DNA链又会重新__________。PCR利用了____________，通过控制______来控制双链的______与结合。5．科学家从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的______________，它的应用解决了______导致__________失活的问题，促成了________的自动化。6．综上所述，PCR反应需要在一定的缓冲液中提供：__________，分别与____________的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的____________，同时通过__________使DNA复制在体外反复进行。答案1．解旋酶DNA母链四种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物2．反向平行3′端5′端3．引物引物碱基互补配对引物的3′端5′端3′端4．双链的解开80～100℃双螺旋结构变性缓慢降低结合成双链DNA的热变性原理温度解聚5．TaqDNA聚合酶高温DNA聚合酶PCR6．DNA模板两条模板链相结合DNA聚合酶控制温度知识点解读知识点一DNA复制1．DNA复制的条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板DNA聚合酶催化合成DNA子链(形成磷酸二酯键)4种脱氧核苷酸合成子链的原料引物(RNA或DNA片段)使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸ATP提供能量2.DNA复制的过程(1)DNA解旋在细胞供应的能量和解旋酶的作用下，氢键断裂、DNA双螺旋打开，成为两条平行的链，实现边解旋，边复制。(2)RNA引物(DNA引物)生成以单链DNA为模板，在酶的作用下合成由20～30个核苷酸合成的小段RNA(DNA)引物。(3)生成单链DNA以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物末端合成子链DNA。【例1】在一个细胞周期中，DNA复制过程中的解旋发生在()A．两条DNA母链之间B．DNA子链与其互补的母链之间C．两条DNA子链之间D．DNA子链与其非互补母链之间【解析】此题考查DNA复制过程。DNA复制时，先要通过解旋酶促进两条母链间的氢键打开而解旋，然后再以母链为模板进行子链的合成。故A正确。【答案】A【例2】关于DNA复制，下列叙述正确的是()A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链B．DNA复制不需要引物C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D．DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸【解析】DNA复制是指利用母链DNA为模板，从5′到3′进行复制合成与亲代DNA完全相同的两个DNA分子的过程。在复制过程中，需要引物，四种脱氧核苷酸，DNA聚合酶等条件，引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合，作为复制的特点。【答案】C知识点二PCR技术1．PCR概念PCR是多聚酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。它有效解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学研究、基因克隆和DNA序列测定等领域。2．PCR的原理在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似。PCR技术利用了DNA的热变性原理：在80～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构解体，双链分开，当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。3．PCR反应的条件(1)稳定的缓冲液，类似于细胞内DNA复制的液体环境。(2)DNA模板，即目的DNA片段。(3)分别与模板DNA两条链相结合的RNA(DNA)引物，作为复制的开始。(4)A、T、G、C四种脱氧核苷酸作为原料。(5)耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶。(6)能严格控制温度，使DNA复制在体外反复进行的设备，一般用PCR仪。4．PCR的反应过程(1)DNA变性(90～96℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。(2)复性(25～65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。(3)延伸(70～75℃)：在Taq酶(在72℃左右活性最强)的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板链互补的DNA链。【例3】PCR技术控制DNA的解聚与结合是利用DNA的()A．特异性B．稳定性C．热变性D．多样性【解析】DNA分子在80～100℃的温度范围内变性，双链解开形成单链，当温度慢慢降低时，两条彼此分离的DNA链又能重新结合形成双链。【答案】C【例4】DNA合成的方向是()A．DNA分子的复制从头开始，一直复制至结束B．从子链的5′端向3′端延伸C．从引物的5′端开始延伸D．从子链的3′端向5′端延伸【解析】DNA分子的复制不能从头开始，只能从3′端延伸DNA链，当引物与DNA母链结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，即A、C、D错误，只有B正确。【答案】B知识点三PCR反应的实验操作1．实验配方(1)稳定的缓冲液环境：加入10倍浓缩的扩增缓冲液5μL。(2)DNA模板：5～10μL，其实际模板DNA的用量在1pg～1mg之间。(3)分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物。根据实验需要预先制备或购买，一般用量是20mmol/L的引物Ⅰ、20mmol/L的引物Ⅱ，各加入2.5μL。(4)脱氧核苷酸混合液：20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL。(5)TaqDNA聚合酶：1～5U/mL的TaqDNA聚合酶1～2U。注意：①PCR所用的缓冲液实验前应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将缓冲液从冰箱中取出，放在冰块上缓慢融化，备用。②PCR所用的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。③在一定条件下，1min内能转化1个微摩尔底物的酶量叫做一个酶单位(U)。2．实验用具(1)PCR仪：PCR自动化程度较高，参照下表设计程序即可。循环数变性复性延伸第1次94℃，10min——30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替。三个恒温水浴锅的温度分别为94℃、55℃和72℃，然后按照上表要求，在三个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管。(3)微量移液器：用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。3．操作步骤(1)准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上(2)移液：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分(1)混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁↓(4)离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是使反应液集中在离心管底部↓(5)反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。说明：①离心管口的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。②用手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。③离心10s的目的是使反应液体集中在离心管底部，提高反应效率。【例5】在PCR实验操作中，下列说法不正确的是()A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合D．离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果【解析】在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，确保实验的准确性。盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；离心10s的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果。【答案】A知识点四结果分析与评价1．DNA扩增数目的理论计算理论上DNA扩增呈指数增长。若只有一条DNA模板，则复制n次后有2n条；若一开始有m条DNA模板，则复制n次后有m×2n条；实际操作过程中由于无关变量的影响，一般来说实验值要略小于理论值。2．DNA含量的测定(1)原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定。(2)过程①稀释：2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释↓②对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零↓③测定：取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值↓④计算：DNA含量(μg/mL)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数3．课题结果评价DNA片段的扩增是否成功的判断(1)对于教材中的方法，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。(2)对于电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。(3)扩增不成功的可能原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。【例6】下列有关PCR的描述，不正确的是()A．是一种酶促反应B．引物决定了扩增的特异性C．扩增产量按y＝(1＋x)n计算D．扩增对象是氨基酸序列【解析】PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原料，在引物作用下使DNA聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝，其扩增产量为y＝(1＋x)n，y代表DNA片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数，因此答案选D。【答案】D思维拓展生物体内DNA复制与PCR反应的区别体内复制PCR反应解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至90℃，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72℃特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次相同点生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行名题赏析近10年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)加热使DNA双链打开，这一步是打开__________键，称为__________，在细胞中是在__________酶的作用下进行的。(2)当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成2条DNA分子，此过程中原料是__________，遵循的原则是__________。(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还有三个条件，即：液体环境、适宜的__________和__________。(