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02微生物的培养与应用课题3分解纤维素的微生物的分离课标解读知识目标1．了解纤维素在生物圈的分布；知道纤维素酶的组成和作用2．知道刚果红染色法的原理；了解两种刚果红染色法的要领能力目标1．体验从土壤中分离分解纤维素的微生物的过程2．学会用两种刚果红染色法对分离分解纤维素的微生物的培养基进行染色情感态度与价值观培养科学思维和创新能力，寻找解决能源危机的新方法。牢固树立科学是第一生产力的观念课前导学1．纤维素的化学组成：____________三种元素，是一种______糖。纤维素的基本组成单位是________，是构成植物________的主要组成成分之一。人体内没有__________________，所以人体不能直接利用纤维素作为能源物质，但土壤中有分解纤维素的微生物，最终把纤维素分解成__________释放到无机环境中去。2．纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括__________、______和__________三种组分，前两种酶使纤维素分解成__________，第三种酶将____________分解成葡萄糖。正是这三种酶的协同作用，纤维素最终被水解成葡萄糖。3．在筛选纤维素分解菌时，人们发明了____________，这种方法能够通过__________直接对微生物进行筛选。其原理是刚果红可与纤维素形成__________，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生反应。4．在含________的培养基中加入刚果红后，刚果红将与培养基中的________形成红色复合物。当__________被__________分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以__________为中心的________。因此，可以通过观察是否产生__________来筛选纤维素分解菌。5．根据刚果红染色法，培养基上长出菌落后，挑选产生________的菌落，即为分解纤维素的菌落。答案1．C、H、O多葡萄糖细胞壁分解纤维素的酶CO2和水2．C1酶CX酶葡萄糖苷酶纤维二糖纤维二糖3．刚果红染色法颜色反应红色复合物4．纤维素纤维素纤维素纤维素酶纤维素分解菌透明圈透明圈5．透明圈知识点解读知识点一纤维素和纤维素酶1．纤维素纤维素是一种复杂的多糖，分子中大约含有几千个单糖单元，相对分子质量约为几十万甚至百万，因此是天然有机高分子化合物。纤维素呈白色、无气味、无味道，是纤维状结构的物质，不溶于水，也不溶于一般有机溶剂。跟淀粉一样，纤维素也不显还原性，可以发生水解，但比淀粉困难，一般需要在浓酸中或用稀酸在加压下才能进行，纤维素水解的最终产物具有还原性。纤维素可用于纺织工业，可造纸；食物中膳食纤维可刺激胃肠蠕动和分泌消化液，有助于食物的消化和排泄等。2．纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖，正是在这三种酶的协同作用下，纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，同样，也可以为人类所利用。人类以淀粉为主要能量来源，但完全不能消化纤维素，而反刍动物和大量的微生物则主要以纤维素为能量来源。这是因为，在反刍动物的瘤胃中生活着大量的可以分解纤维素的微生物。3．纤维素的分解进入土壤的植物残体中含有大量纤维素。能分解纤维素的微生物，有各种细菌，真菌和少数放线菌。它们的共同特点是能分泌纤维素酶。4．实验验证试管滤纸条0.1mol/L醋酸—醋酸钠缓冲溶液pH＝4.8纤维素酶70～80U/mL条件结果11×6cm10mL1mL时间足够长，滤纸被完全分解21×6cm10mL－两试管固定在50mL锥形瓶中，在摇床上以140r/min的转速振荡反应1h基本无变化【例1】纤维素、纤维素酶和控制纤维素酶合成的物质，它们的基本组成单位依次是()A．葡萄糖、葡萄糖和氨基酸B．葡萄糖、氨基酸和核苷酸C．氨基酸、氨基酸和核苷酸D．淀粉、蛋白质和核酸【解析】纤维素是葡萄糖的多聚体，其基本组成单位是葡萄糖，纤维素酶的化学本质是蛋白质，其基本组成单位是氨基酸，而纤维素酶是由基因控制合成的，基因是有遗传效应的DNA片段，其基本组成单位是核苷酸。【答案】B【例2】纤维素酶可以将哪种物质分解()A．牛肉片B．鱼片C．滤纸条D．塑料条【解析】纤维素酶只能使纤维素分解。本题中只有C项滤纸条的主要成分是纤维素，所以可以将滤纸条分解。【答案】C知识点二纤维素分解菌的筛选纤维素分解菌的寻找过程中，人们发现了刚果红染色法，最后再进一步鉴定。1．选择培养分解纤维素的细菌的选择培养是用培养液中含纤维素的液体培养基来完成的。其培养基的配方如下：培养基组成提供主要的营养物质纤维素粉5g碳源(能源)NaNO31g氮源、无机盐Na2HPO4·7H2O1.2g、KCl0.5g、KH2PO40.9g、MgSO4·7H2O0.5g无机盐酵母膏0.5g生长因子、碳源、氮源水解酪素0.5g氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容1000mL水2.刚果红与刚果红法筛选菌株原理刚果红(简称CR)是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的红色复合物就不能形成，培养基中就出现了以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过观察是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。3．筛种鉴定筛选菌种后，要在鉴定培养基上进行鉴定。所用的鉴定培养基为CMCNa培养基，是固体培养基。其组成成分如下：培养基组成提供的主要营养物质CMCNa5～10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生长因子KH2PO40.25g无机盐土豆汁100mL碳源、生长因子琼脂15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素说明：①在纤维素分解菌分离鉴定过程中，所用的选择培养基为液体培养基，鉴定培养基为固体培养基，在液体培养基中筛选的同时，又有富集培养目的菌提高浓度的作用。②纤维素作为纤维素分解菌的唯一碳源和能源存在，在只含有纤维素为碳源的培养基中，不能分解纤维素的微生物由于缺乏碳源而不能正常生长繁殖，因而能起选择作用。【例3】下表是某培养液成分含量表。请据表回答：编号①②③④⑤⑥成分NH4HCO3KH2PO4CaSO4FeCl2维生素H2O含量0.5g0.3g0.5g0.5g少许100mL(1)若用于培养微生物，该培养液中有________类营养物质，可培养的微生物的同化作用类型是________。(2)此培养液若用来培养固氮微生物，则应除去的成分是________。应加入的物质是________。(3)若用该培养液进行植物的无土栽培，则________成功，原因是________。(4)若用该培养液培养纤维素分解菌，应加入的物质是________，为检测纤维素分解菌的存在与否还应加入________，若存在将呈________。【解析】微生物生长一般需要碳源、氮源、生长因子、水、无机盐。这个培养基就能提供上述五种营养物质。而本培养基只有无机碳源，没有有机碳源，所以只能培养自养型微生物。固氮微生物的培养基中可以不要氮源，所以培养固氮微生物时可除去①——NH4HCO3。但是固氮微生物是异养的，需加入有机物为其提供碳源。植物生长的必需矿质元素有N、P、S、K、Ca、Mg、Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Cl、Ni14种，缺少则植物不能正常生长。本培养基矿质元素不全，不适合无土栽培植物。培养纤维素分解菌应选用以纤维素为惟一碳源的培养基进行选择培养，并利用刚果红染色法进行鉴定。【答案】(1)五自养型(2)①有机物(3)不能必需矿质元素种类不全(4)纤维素粉刚果红红色知识点三实验设计(1)分离分解纤维素的微生物的实验流程示意图(如下图所示)。(2)具体实验步骤①土壤取样：应选择富含纤维素的环境，因为在纤维素含量丰富的环境中通常聚集较多的分解纤维素的微生物，用无菌小铁铲铲去表层土，迅速铲取土壤并装入无菌信封，密封。②选择培养：a.培养基的制备。b．具体操作(如下图)：称取土样20g加入装有30mL培养基的锥形瓶―→锥形瓶置于摇床上培养液变浑浊―→c．设置对照：将c过程中的选择培养基改为不含纤维素的培养基，如牛肉膏蛋白胨基础培养基，其余过程均与c过程相同。③梯度稀释：用1mL无菌吸管从选择培养基中吸取1mL培养液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀；然后再用一支1mL无菌吸管从此试管中吸取1mL菌液注入另一支盛有9mL无菌水的试管中，以此类推配制成101、102、103、104、105、106倍的各种稀释液。④涂布培养：将鉴别培养基三个平板分别用记号笔定上104、105、106倍的三种稀释液，另取三个不含纤维素的培养基平板，分别用记号笔写上104、105、106倍的三种稀释液；然后用三支1mL无菌吸管分别由104、105、106倍的三管稀释液中吸取0.1mL对号滴入已写好稀释度的平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。将培养基平板倒置于30～37℃温室中培养1～2d，每隔24h观察菌落情况。⑤刚果红染色：a.方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，过程如下：培养基经涂布培养长出菌落→覆盖1mg/mL的CR溶液倒去CR溶液→加入1mol/L的NaCl溶液倒掉NaCl溶液→出现透明圈。b．方法二：倒平板时就加入刚果红，过程如下：配制10mg/mL的CR溶液→灭菌→按照每200mL培养基加入1mL的比例加入CR溶液→混匀→倒平板→接种后培养→出现透明圈。⑥挑选产生透明圈的菌落：挑取产生明显透明圈的菌落并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在30～37℃下培养，可获得纯培养物。【例4】某同学为了从土壤中分离得到纤维素分解菌，进行以下操作：第一步：土壤取样：用小铁铲和普通信封将土取回，然后倒入一烧瓶中，加蒸馏水稀释，塞好棉塞。第二步：制备培养基：纤维素粉5gNaNO31gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5gKCl0.5g酵母膏0.5g水解酪素0.5g将上述物质溶解后加蒸馏水定容到1000mL。第三步：菌悬液涂布平板：用接种环取少量土壤稀释溶液在以上培养基表层涂布。第四步：培养观察：把接种好的培养基放到35℃的恒温箱中培养1～2天，观察并记录菌落的生长情况。根据以上实验操作，完成下列问题：(1)找出该同学明显的操作错误。(2)要想增加该实验的说服力，还应该怎么做？【解析】本题主要考查对从土壤中分离微生物的流程的操作要求的理解，该实验步骤没有什么问题，但前三个步骤都没有进行无菌操作。无法说明培养基中的微生物一定来自土壤。要想增强说服力，应设置对照组，另外该实验还应该对菌种作进一步的鉴定。【答案】(1)第一步：取样工具应提前灭菌；不能用蒸馏水，应该用无菌水；该操作应该在火焰旁进行。第二步：培养基配制好后应灭菌。第三步：接种应在无菌条件下进行，应用灭菌的吸管或移液器取稀释液。(2)一是设置对照实验，需再配制一组无纤维素的培养基，接种上该土样培养观察；二是最后要对菌落进行鉴定；用刚果红染色法鉴定菌落周围是否出现透明圈。知识点四结果评价与知识延伸1．结果评价(1)培养基是否合格：在培养过程中，若对照培养基没有菌落生长，则说明培养基制作合格。(2)是否筛选出纤维素分解葡萄落：刚果红染色后，若观察到透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的菌落，但不一定是分解纤维素的细菌，也有可能是真菌或放线菌。因为在土壤中细菌数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易得到的是细菌，但由于所取土样不同，可能得到不同的菌落，但都是分解纤维素的微生物。2．知识延伸对通过刚果红染色法分离得到的纤维素分解菌需进行进一步鉴定。其原因是：由于形成的菌落与其他菌落混杂，因此产生透明圈的菌落也可能是能产生淀粉酶的微生物，也可能是降解刚果红的菌种形成的，因此需进一步鉴定。(1)鉴定原理：通过微生物发酵，看能否产生纤维素酶。发酵的方法分为固体发酵和液体发酵。若发酵产物中有纤维素酶，则菌种是分解纤维素的菌。(2)纤维素酶的鉴定方法：通过