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专题1基因工程1.2基因工程的基本操作程序课前·新知导学课堂·考点突破课后·提能达标课前·新知导学一、基因工程的基本操作程序1__________的获取→2_______________的构建→将目的基因导入3___________→目的基因的4___________。目的基因基因表达载体受体细胞检测与鉴定二、目的基因的获取1．从基因文库中获取(1)基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多5___________，导入6___________的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。(2)基因文库的种类①基因组文库：包含一种生物的7___________基因。②部分基因文库：包含一种生物的8___________基因。DNA片段受体菌所有一部分2．利用PCR技术扩增(1)原理：9_________________________。(2)过程DNA双链复制90~95℃引物Taq酶3．人工合成(1)条件：基因比较小，13___________又已知。(2)方法：通过14___________用化学方法直接人工合成。核苷酸序列DNA合成仪三、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1)使目的基因在受体细胞中15___________，并且可以16___________给下一代。(2)使目的基因能够17___________和发挥作用。稳定存在遗传表达2．基因表达载体的组成首端RNA聚合酶转录目的基因尾端标记基因四、将目的基因导入受体细胞1．导入植物细胞(1)农杆菌转化法①原理：农杆菌Ti质粒上的24___________可整合到受体细胞的染色体DNA上。②适用范围：主要适用于25___________和26___________。(2)27___________：常用于单子叶植物。(3)花粉管通道法：目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。TDNA双子叶植物裸子植物基因枪法2．导入动物细胞(1)常用方法：28___________技术。(2)受体细胞：29___________。显微注射受精卵3．导入微生物细胞(1)方法：感受态细胞法，即用30___________处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为31___________)。(2)常用原核生物作为受体细胞的原因：32___________、多为单细胞、遗传物质相对33___________等。Ca2＋感受态细胞繁殖快较少五、目的基因的检测与鉴定1．分子水平的检测[连线]2．个体水平的鉴定(1)34___________的接种实验。(2)对基因工程产品与天然产品的功能进行35___________。抗虫或抗病活性比较[正误辨析]1．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。()2．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。()3．把目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。()××√4．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达。()5．检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。()6．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。()×√×[易错易混]基因工程操作程序中的“三、三、二、一”(1)目的基因“三种获取方法”①从基因文库中获取(基因组文库、cDNA文库)；②利用PCR技术扩增：其实质是在体外对目的基因进行大量复制。用PCR仪控制温度：变性(90～95℃)→复性(55～60℃)→延伸(70～75℃)；③通过DNA合成仪用化学方法人工合成(用于核苷酸序列已知，且核苷酸数目较少的基因)、利用mRNA反转录法合成。(2)将目的基因导入受体细胞的“三种类型”①导入植物细胞——农杆菌转化法(花粉管通道法、基因枪法)；②导入动物细胞——显微注射法(导入受精卵)；③导入微生物细胞——转化法。(3)目的基因检测与鉴定的“两个水平”(4)基因工程操作的“一个核心”——基因表达载体的构建。课堂·考点突破考点一目的基因的获取角度1从基因文库中获取和人工合成1．为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。据图回答：(1)图中基因组文库________(填“小于”“等于”或“大于”)cDNA文库。(2)B过程需要的酶是________；A、C过程中________(填“可以”或“不可以”)使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。(3)目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中________和________为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是______________。解析：分析获取植酸酶基因的流程图可知，图中基因组文库大于cDNA文库。B过程需要的酶应该是逆转录酶；因为A、C过程的目的是筛选出含相同基因的菌株，可以使用同一种探针进行筛选。目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。答案：(1)大于(2)逆转录酶可以(3)DNAcDNA耐高温角度2利用PCR技术扩增目的基因2．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括______________和______________。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是___________________________。解析：(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是解旋酶。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是加热至90～95℃。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。答案：(1)基因组文库cDNA文库(2)解旋酶加热至90～95℃氢键(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活[归纳提升]从五个方面正确理解PCR技术(1)DNA单链有方向性，DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。(2)注意不同酶的作用：解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。(3)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。(4)PCR过程中无解旋酶，破坏氢键需要升高温度，但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键，因此，热变性后产生的是DNA单链，并不是脱氧核苷酸。(5)复性只是引物与DNA单链的结合，并未形成子链DNA，子链DNA是在延伸阶段形成的。考点二基因表达载体的构建和目的基因的导入角度1基因表达载体的构建1．下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是()A．基因表达载体的构建是在生物体外完成的B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因解析：选B由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方式不同，所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千篇一律。2．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________________；并且____________________和____________________的细胞也是不能区分的，其原因是___________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有______________的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________________。解析：(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。答案：(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞角度2目的基因的导入3．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是()A．基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济和有效B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C．大肠杆菌最常用的转化方法，是使细胞的生理状态发生改变D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法解析：选A不同受体细胞导入目的基因的方法不同，每种方法都有利弊。目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济和有效，A错误，D正确；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，B正确；目的基因导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用Ca2＋处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化，C正确。4．科学家通过基因工程，成功培育出能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉，其过程大致如图所示。(1)细菌的基因之所以能“嫁接”到棉花细胞内，原因是________________________________________________。(2)上述过程中，将目的基因导入棉花细胞内使用了_____________法，这种导入方法较经济、有效。目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是_______________________________，还需要通过检测才能知道，检测采用的方法是_________________。(3)利用基因工程技术培育抗虫棉，相比诱变育种和传统的杂交育种方法，具有________