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第一章无菌操作技术实践第2课时微生物分离和培养的技术操作(以大肠杆菌为例)第一章无菌操作技术实践学习导航明目标、知重点难点了解培养基的配制过程及培养基的配制原则。(重点)掌握无菌操作和接种技术。(重、难点)阅读教材P10～14分析大肠杆菌的接种与分离培养1．配制牛肉膏蛋白胨培养基配制培养基→___________→分装→包扎→灭菌→搁置斜面调节pH2．斜面接种和培养大肠杆菌斜面接种大肠杆菌的主要目的有___________、___________和保存纯净菌种等。具体操作步骤：准备接种→___________→试管口灭菌→挑取少许菌种→___________→培养大肠杆菌→___________菌种转移扩大培养接种环灭菌划线接种保存菌种3．平板划线分离和培养大肠杆菌在实验室中，平板常常被用来___________细菌等微生物。(1)牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板制作配制好的培养基装瓶――→加棉塞___________→倒平板操作(A.打开瓶塞→B._____________→C.倒培养基→D.___________)培养、分离灭菌灼烧瓶口灭菌倒置平板(2)平板划线分离与培养大肠杆菌①平板划线法的含义：用带有微生物的___________在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。②注意事项：接种和划线操作时需要在___________附近进行。③培养结果：可以得到由单个细菌增殖而形成的___________。接种环酒精灯火焰菌落判一判(1)锥形瓶的瓶口通过火焰灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。()(2)平板冷凝后，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。()√√(3)制备细菌培养基的操作顺序为配制培养液、调节pH、灭菌、分装。()(4)使用已灭菌的接种环、培养基，操作过程中不再灭菌。()××连一连培养基的配制利用培养基培养微生物首先要把微生物接种到培养基上，在实验室中，平板常常被用来培养、分离细菌等微生物。结合教材P10～14内容完成以下探究。探究1下表是牛肉膏蛋白胨固体培养基的成分，请说出各成分提供的营养培养基组分提供的主要营养物质牛肉膏5.0g__________________________蛋白胨10.0g__________________________NaCl5.0g_____________________H2O定容至1000mL氢元素、氧元素碳源、氮源、磷酸盐和维生素碳源、氮源和维生素无机盐探究2完善下面牛肉膏蛋白胨培养基的配制步骤，学会培养基的配制配制___________↓调节_________至________↓分装：培养基的高度约为试管长度的______↓培养基pH7.21/5___________↓灭菌：高压蒸汽灭菌是常用的灭菌方法之一↓搁置斜面：待试管冷却至_________左右，斜面长度不超过试管总长的_________包扎50℃1/21．培养基的配制原则(1)目的明确：不同微生物需求不同，根据培养目的进行配制。(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾。2．培养基配制中的注意事项(1)用天平称量时，注意放等大的称量纸。(2)培养基熔化中的注意事项①在琼脂熔化时要不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。②熔化后需要先调节pH，再分装，后灭菌。(3)培养基倒平板时的注意事项①培养基灭菌后要冷却到50℃左右时开始倒平板。其原因是琼脂是一种多糖，在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板时高于50℃会烫手，低于50℃时，若不能及时操作，琼脂会凝固。②倒平板时，要使锥形瓶的瓶口通过火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。倒平板整个过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。③平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。④在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。1．下列有关培养基配制原则的表述，正确的是()A．任何培养基都必须含有碳源、氮源、矿质元素、水及生长因子B．碳源和氮源必须具有一定比例，碳元素的含量最多，其次为氮元素C．微生物的生长除受营养因素影响外，还受到pH、氧气、渗透压的影响D．营养物质的浓度越高越好解析：选C。培养基中一般含有碳源、氮源、无机盐和水等，有些培养基中还需加入生长因子。培养基中的碳源和氮源要有一定的比例，并不一定碳元素含量最多。营养物质浓度过高会导致微生物失水死亡。2．下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是()A．操作顺序为计算、称量、熔化、搁置斜面、灭菌B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯C．待培养基冷却至50℃左右时进行搁置斜面D．斜面培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的1/2答案：A大肠杆菌的接种观察下图接种操作程序，学会斜面接种和培养大肠杆菌。向上准备接种：用一只手的大拇指和其他四指夹住菌种试管，管口并齐，管内培养基斜面__________环端迅速彻底灭菌接种环灭菌：手持接种环，将接种环的___________和接种时可能进入试管内的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次，以达到________________的目的↓↓试管口灭菌：在火焰边用握有接种环的手的小指、无名指、中指和掌心拔去两支试管上的试管塞，迅速将试管口通过火焰2～3次，以杀灭试管口上的微生物顶端或其他无菌冷却试管壁挑取少量菌种：将接种环伸入有菌种的试管内，让环部先接触培养基斜面________________的部位使其___________。然后，轻轻挑取少许菌种，在抽出接种环时，其带菌部位不要触及___________，也不要通过火焰处↓↓划线接种：将上述带菌的接种环伸入待接种的试管中，在培养基斜面上由___________向上轻轻划“S”型曲线。注意划曲线时不要将培养基表面___________底部划破接种环抽出接种环：将试管口和试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管。多次灼烧___________确保无菌，冷却后，放回原处↓↓恒温箱培养：将接种过菌种的试管放在___________中(37℃)培养24h，观察接种和培养的结果保存菌种：将增殖的菌种放置在冰箱冷藏室中(4℃)保存↓1．接种成功的标准如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，实验失败，需要分析原因，再次接种。2．接种时的几个注意事项(1)接种过程需要两支试管：一支试管含有菌种，另一支试管含有培养基，用于接种；(2)接种过程中为杀灭试管口上沾染的微生物要对试管口进行灭菌；(3)带菌的接种环抽出试管时带菌部分不可触及试管壁；(4)接种划线时不要将培养基的表面划破。1．下列关于接种操作过程的叙述，不正确的是()A．要将接种环灼烧灭菌B．取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌C．将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位D．接种后还要将管口灭菌加塞解析：选C。接种环伸入试管内后先接触未长菌的部位，待接种环冷却后再接触长菌部位。2．下列关于接种微生物的叙述，错误的是()A．用玻璃涂布器进行涂布平板接种B．用接种针进行穿刺接种C．常用接种工具有玻璃涂布器、接种环等D．使用接种工具时不用灭菌答案：D大肠杆菌的分离和培养完善下面示意图，学会分离和培养大肠杆菌。1．平板划线法的类型：有扇形划线、连续划线、交叉划线、方格划线等(如下图)。2．平板划线操作的注意事项(1)第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环，划线结束后仍需灼烧接种环，三次灼烧的目的不同。项目目的第一次划线前灼烧避免接种环上可能存在的微生物污染培养物每次划线前灼烧杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种均来自上次划线末端划线结束灼烧杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者(2)灼烧接种环之后，要待其冷却后才能伸入菌液中，以免温度太高杀死菌种。(3)除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，这样能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。(4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。1．斜面培养基正确的划线示意图是()解析：选A。正确的接种方法是将带菌的接种环伸入待接种的试管中，在培养基表面上由底部向上轻划“S”型曲线，将菌种接种到培养基上。2．下列有关平板划线操作的叙述，不正确的是()A．第一次操作前灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种C．在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液D．划线结束后，灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境或感染操作者解析：选C。平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，以形成单菌落。因此，每次划线时，都应将接种环上原有的菌体杀死，划线时分散的菌体来自上次划线结束时的菌体。核心知识小结[网络构建]核心知识小结[关键语句]在无菌条件下将微生物接入培养基．．．的操作过程叫做接种。细菌培养基的配制过程：配制培养基→调节pH→分装→包扎→灭菌．．→搁置斜面。本部分内容讲解结束按ESC键退出全屏播放