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第四章生物化学与分子生物学技术实践第一节生物成分的分离与测定技术第1课时蛋白质的分离与提取第四章生物化学与分子生物学技术实践学习导航明目标、知重点难点掌握电泳法分离大分子的原理。(重点)运用常用的方法提取和分离蛋白质。(重、难点)一、阅读教材P71～72分析蛋白质的分离与纯化1．生物细胞中的蛋白质提取(1)在提取蛋白质时，可以采用___________与___________结合的方法将生物组织或细胞完全破碎，使蛋白质从细胞中释放出来，并使其溶解在适当的___________中。研磨超声波抽提液(2)抽提液的选择需要根据________________而定，一般酸性蛋白质用___________溶液抽提，碱性蛋白质用___________溶液抽提，脂蛋白等则可用___________抽提。2．蛋白质的分离方法(1)离心沉降法：通过控制___________，使分子大小、___________不同的蛋白质发生沉降分层。(2)薄膜透析法：利用蛋白质分子不能透过___________的特性，使___________与其他小分子化合物分离的方法。蛋白质的特性偏碱性偏酸性有机溶剂离心速度密度半透膜蛋白质(3)凝胶色谱法①概念：根据_______________的大小差异对其进行有效分离的方法。②原理a．凝胶形态：微小的多孔球体组成：大多由______________构成结构：内部具有很细微的______________蛋白质分子量多糖类化合物多孔网状结构b．分离的过程进入凝胶颗粒内部的难易程度路程移动速度小分子蛋白质___________较长___________大分子蛋白质无法进入___________较快(4)电泳法：将所带电荷的数量和性质不同的蛋白质从混合样品中分离并纯化出来。容易较慢较短二、阅读教材P73～77完成血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及凝胶色谱法分离血红蛋白的操作1．血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳配制试剂→准备器材→___________→浸泡薄膜→___________→___________→实施电泳→___________→漂洗→脱色。2．凝胶色谱法分离血红蛋白样品处理→血红蛋白的释放、分离和___________→凝胶的制备→色谱柱的装填→样品的加入→___________。架滤纸桥细心点样平悬薄膜染色透析洗脱与收集判一判(1)酸性蛋白质用酸性溶液抽提，水溶性蛋白质用透析液抽提，脂溶性蛋白质用稀碱性溶液抽提。()(2)电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其电性相反的电极移动的过程。()(3)电泳时泳动速度取决于带电颗粒的大小、形状、所带静电荷多少。()×√√×√×(4)离心沉降法和薄膜透析法分离蛋白质的原理是一样的。()(5)凝胶色谱法是根据蛋白质分子量的大小而对其进行有效分离的方法。()(6)醋酸纤维薄膜电泳是采用滤纸为支持物的电泳方法。()蛋白质分离技术欲研究某种蛋白质的结构、性质和功能，需将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化出来。结合教材P71第三段～P74内容完成以下探究。(2)目的：使___________________的不同种类的蛋白质发生沉降分层，彼此分离。探究1完善下面示意图，理解离心沉降法分离蛋白质(1)原理：在离心力的作用下，_______________________的分子沉降速度不同，从而被分离。分子大小、密度不同分子大小、密度不同探究2仔细观察下面示意图，分析薄膜透析法分离蛋白质(1)原理：蛋白质分子不能透过___________。(2)目的：去除_________________杂质，如无机盐、单糖、二糖以及氨基酸等。半透膜小分子化合物透析液(3)常用的半透膜：肠衣、玻璃纸等。(4)步骤：将待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析袋放入___________中即可。探究3完善下面示意图，分析凝胶色谱法分离蛋白质(1)大分子蛋白质不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙移动，洗脱路程___________，移动速度__________，最先流出柱外。(2)小分子蛋白质可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，洗脱路程___________，移动速度___________，以致需要较长时间才能流出柱外。较短较快较长缓慢1．蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术，下列有关叙述不正确的是()A．根据蛋白质分子不能通过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳分离蛋白质C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质解析：选A。蛋白质分子不能通过半透膜，但溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离，A项错误；电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现蛋白质分子的分离，B项正确；凝胶色谱法的原理是：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快，而分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢，所以可以根据蛋白质相对分子质量的大小，通过凝胶色谱法使大分子的蛋白质先洗脱出来，小分子的蛋白质后洗脱出来，从而实现蛋白质分子的分离，C项正确；根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法使不同密度的蛋白质分子位于不同层次的离心液中，从而实现蛋白质的分离，D项正确。2．下列有关蛋白质提取和分离的说法，错误的是()A．透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性B．采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来C．离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离D．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷电性相同的电极方向移动解析：选D。蛋白质是生物大分子，不能通过半透膜，而其他小分子可以通过半透膜，可以利用半透膜进行分离得到蛋白质，A、B正确。分子大小、密度不同的蛋白质其离心速率不同，通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离，C正确。蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷电性相反的电极方向移动，D错。实验步骤操作方法配制试剂配制___________液、染色液、漂洗液、___________液准备器材醋酸纤维薄膜、常压电泳仪、点样器等血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳结合教材，完善下表，理解血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳。巴比妥缓冲透明↓↓架滤纸桥取双层滤纸条，一端与___________对齐，另一端浸入电泳槽的缓冲液中，待滤纸条湿润后，驱除___________，使滤纸紧贴于支架上浸泡薄膜用镊子夹取醋酸纤维薄膜，识别出光泽面，并在光泽面的一角用笔做上___________，然后放在_____________中浸泡20min支架前沿气泡记号巴比妥缓冲液↓↓细心点样取出薄膜，吸去多余液体，平铺在玻璃板上，有___________的一面朝下，点样时将盖玻片在血清中蘸一下，在薄膜一端___________处轻轻按下，点上细条状的血清样品，随即提起记号2cm↓平悬薄膜将点样端平贴在电泳槽负极支架的滤纸桥上，有___________的一面朝上，另一端平贴于___________，呈绷直状态实施电泳盖上电泳槽盖，在醋酸纤维薄膜平衡约10min后接通电源，电泳___________min记号正极60～90↓↓染色取下薄膜，放入___________中浸泡5～10min漂洗取出薄膜，在漂洗液中漂洗数次，直至___________________________为止染色液蛋白质区底色脱净↓↓脱色用滤纸压平并吸干薄膜后，再浸入___________中约5min，取出后平贴于玻璃板上，待完全干燥后便形成___________图谱透明液透明薄膜1．电泳的泳动规律带电颗粒直径越小、越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。2．关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的几点说明(1)薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。(2)点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。(3)点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。(4)点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适中，不宜过多或过少。(5)电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。(6)应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。1．仔细观察下面血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱，所带负电荷少的球蛋白是()A．α1球蛋白B．α2球蛋白C．β球蛋白D．γ球蛋白解析：选D。对于几种球蛋白来说直径相差不大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极，且γ球蛋白距点样处最近，所以γ球蛋白所带负电荷最少。2．下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的说法中，不正确的是()A．架滤纸桥时，待滤纸条湿润后，要驱除气泡，以便使滤纸紧贴于支架上B．浸泡薄膜时要识别出光泽面，并做记号C．平悬薄膜时，有记号的一面朝上D．从染色液中取出薄膜后，用滤纸条压平并吸干，再浸入透明液中脱色解析：选D。薄膜染色后要先放入漂洗液中漂洗直至蛋白质区底色脱净为止，然后才用透明液脱色。低速短时间凝胶色谱法分离血红蛋白凝胶色谱法是根据蛋白质分子的大小，对其进行有效分离的方法。结合教材P75第三段～P77内容完成下列过程(以哺乳动物红细胞为例)，学会凝胶色谱法分离血红蛋白。1．样品处理：采集血样→___________离心→取红细胞，倒入烧杯＋5倍体积生理盐水搅拌→低速离心→重复3次→洗净的红细胞。2．血红蛋白的释放、分离和透析(1)血红蛋白的释放：红细胞＋蒸馏水＋甲苯搅拌，红细胞破裂而释放出血红蛋白。(2)分离血红蛋白溶液：将混合液以___________r/min的速度离心10min，试管中形成4层，取自上而下的第____层红色透明液体(血红蛋白水溶液)。(3)透析：将盛有1mL血红蛋白溶液的透析袋放入盛有物质的量浓度为20mmol/L的___________中透析12h。20003磷酸缓冲液3．凝胶的制备：将交联葡聚糖凝胶用___________充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。4．色谱柱的装填固定：将层析柱___________固定在支架上↓装填：将凝胶悬浮液___________性缓慢倒入色谱柱内↓洗涤平衡：用20mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填___________蒸馏水垂直一次紧密5．样品的加入(1)加样示意图(2)打开色谱柱下端的___________，让凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面刚好平行，___________出口。用滴管小心吸取1mL样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱顶端，不能破坏凝胶面。然后，___________流出口，使样品液逐渐渗入凝胶。流出口关闭打开6．洗脱与收集(1)洗脱：洗脱液流速为每分钟___________。(2)收集：待___________色的蛋白质接近色谱柱出口时，用试管收集洗脱液，每_________mL收集一管，连续收集。1mL红5(1)凝胶色谱制备中严禁出现气泡，为什么？提示：气泡会打乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。(2)用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质的纯度鉴定时，为何仅仅取决于分子量的大小？提示：SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原，十二烷基硫酸根所带的负电荷使各种蛋白质—SDS复合物都带上大大超过了蛋白质分子原有的负电荷量，所以不受蛋白质原有电荷的影响。SDS与蛋白质的结合引起蛋白质构象改变，使不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，所以不受蛋白质形状的影响。故仅仅取决于蛋白质分子量的大小。蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析相对分子质量大相对分子质量小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径小于凝胶颗粒空隙直径运动方式垂直向下运动不规则的扩散运动运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱次序先从凝胶柱中洗脱出来后从凝胶柱中洗脱出来突破1血红蛋白提取和分离的过程及原理1．下列关于血