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第四章生物化学与分子生物学技术实践第二节分子生物学技术第四章生物化学与分子生物学技术实践学习导航明目标、知重点难点尝试PCR(多聚酶链式反应)技术的基本操作。(重、难点)体验PCR这一常规分子生物学实验方法。(难点)理解PCR的原理，讨论PCR技术的应用。(重点)一、阅读教材P83分析使用PCR仪的安全措施1．严禁在PCR仪运行过程中打开___________，否则会造成仪器的永久损坏。2．仪器运行时，______________内表面温度较高，当心灼伤。3．仪器运行时，加热器内腔为___________环境，严禁触及。池盖样品池及池盖高温、高压4．仪器运行过程中如果发出尖锐的刺刮声音，请立刻停止___________，检查是否有___________断裂等故障。5．仪器运行过程中如果没有反应，请切断___________，进行检查。6．必须保持样品池内部的___________，可用蘸有体积分数为95%的酒精棉签擦拭相关部位。运行微量离心管电源清洁7．仪器必须放置在________________里，操作者在操作的时候必须遵循PCR实验室的相关规定，做好穿___________、戴___________等相关防护措施。8．当仪器接通电源后，打开外壳或移走部件可能会造成人员伤害，因此，在进行任何调整、替换、保养或维修之前，请切断___________。PCR实验室防护服防护手套所有的电源二、阅读教材P84完成多聚酶链式反应程序1．物质准备：向离心管中加入___________、___________和4种脱氧核苷酸以及________________。2．变性：在___________℃高温下，作为模板的双链DNA___________为单链DNA。3．退火(复性)：反应体系的温度降至_______℃，___________与单链DNA上的特定部位相互配对。模板DNA引物TaqDNA聚合酶94解旋55引物4．延伸：反应体系的温度回升到________℃左右，按照单链DNA上的脱氧核苷酸序列，4种脱氧核苷酸按照_______________原则，在TaqDNA聚合酶的作用下连接到引物之后，使引物链延伸，形成互补的___________。72碱基互补配对DNA双链三、阅读P85～87分析目的DNA片段的体外扩增与鉴定1．DNA片段的PCR扩增(1)准备器材：PCR仪、台式高速离心机、0.2mLPCR微量离心管等。(2)在0.2mLPCR微量离心管中加入__________________缓冲液，_____________________的溶液各5μL，___________模板DNA，________引物1和5μL引物2，___________双蒸水。5μL10倍浓缩的PCR4种脱氧核苷酸1μL5μL29μL(3)煮沸___________之后冰浴___________，低速离心，按照1单位/μL加入________________。(4)扩增DNA片断的反应程序：将微量离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。在___________的条件下预热5min，再设置反应程序为：_______，_______→______，_____→_______，_____(以上过程循环30次)。最后一次延伸条件为________，_______。(5)按照PCR仪器操作要求运行反应程序。5min2minTaqDNA聚合酶94℃94℃30s55℃30s72℃1min72℃1min2．DNA分子的测定(1)配制二苯胺试剂：分别配制A液(1.5g二苯胺溶于100mL___________中，再加入1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存)和B液(体积分数为0.2%的___________溶液)。将0.1mLB液加入10mLA液中，混匀。(2)条件：在___________中加热。(3)现象：出现___________现象。冰醋酸乙醛沸水浴蓝色判一判(1)DNA扩增的变性过程中需要DNA解旋酶的参与。()(2)DNA扩增退火过程中需要DNA聚合酶的参与。()(3)DNA延伸过程需要TaqDNA聚合酶的作用。()(4)所有PCR中使用的引物都是相同的。()××√×连一连多聚酶链式反应多聚酶链式反应技术又叫PCR技术。通过PCR技术就可以在体外对DNA的特定片段进行快速的复制，并获得大量的目的基因。结合教材P84内容完成以下探究。探究1结合图示理解PCR反应的过程及结果(1)PCR反应过程①变性：当温度上升到94℃左右时，双链DNA解旋为单链(如图)。两种引物②退火：系统温度下降至55℃时，___________通过碱基互补配对与两条单链DNA结合(如下图)。TaqDNA聚合酶③延伸：当系统温度上升至72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在________________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链(如图)。DNA序列呈指数扩增(2)结果①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、退火、延伸三步。②两引物之间的固定长度的_______________________。探究2结合教材，推算PCR扩增数目的理论值理论上DNA扩增呈指数增长，若只有一个DNA模板，则复制n次后有__________个DNA；若一开始有m个DNA模板，则复制n次后有___________个DNA。2nm×2n讨论解旋酶、DNA聚合酶与DNA连接酶的作用？提示：解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都可催化形成磷酸二酯键；DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′羟基上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。PCR体外扩增DNA与生物体内DNA复制的比较体内复制PCR反应不同点解旋在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开加热至94℃左右，双链全部解开体内复制PCR反应不同点合成子链一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72℃左右特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增体内复制PCR反应不同点DNA聚合酶需要需要TaqDNA聚合酶循环次数受生物体自身控制30次温度体内温和条件高温(可变)产物完整DNADNA片段体内复制PCR反应相同点①需提供DNA复制的模板；②以四种脱氧核苷酸为原料；③都需要一定的缓冲溶液突破1PCR过程与细胞内的DNA复制过程区别1．如图表示细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增两个过程，两反应过程的条件中相同的是()A．模板B．原料C．酶D．能量供应解析：选B。选项A模板不同，胞内DNA复制以整个DNA分子作为模板，PCR扩增却以一段目的DNA作为模板。选项B原料相同，均以4种脱氧核苷酸为原料。选项C酶不相同，胞内DNA解旋需要解旋酶，延伸需要DNA聚合酶等；胞外PCR扩增通过高温解旋而不需要解旋酶，延伸只需热稳定的TaqDNA聚合酶。选项D能量供应不同，胞内DNA复制过程由ATP提供能量，而PCR扩增主要由外界供能。突破2PCR扩增的过程2．近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。据此回答下列问题：(1)加热使DNA双链间的________键完全打开，称为________；而在细胞中是在________酶的作用下进行的。(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入________种特定的引物。(3)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________。解析：(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为变性，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(94℃左右)、退火(40～60℃)、延伸(72℃左右)，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。(3)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。答案：(1)氢变性解旋(2)两(3)1/8PCR扩增原理的有关拓展(1)DNA热变性：双链DNA变性DNA。(2)理论上DNA扩增呈指数增长，实验值要略小于理论值。实际操作过程中，由于无关变量的影响，一般来说，实验值要略小于理论值。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段序列呈指数扩增。目的DNA片段的体外扩增与测定目的DNA片段的PCR扩增是在PCR仪中进行。结合教材P85～87内容完成以下探究。探究1完善下列步骤，学会目的DNA片段的体外扩增的操作过程引物自动取液器低速947272准备材料：离心机、离心管、PCR仪、缓冲液、_________、原料等移液：用__________按照配方在微量离心管中依次加入各,成分离心：煮沸、冰浴处理，______离心使溶液集中于管底扩增：将离心管放入PCR仪上，按照_____℃、30s→55℃、30s→____℃、1min（以上过程循环30次）→____℃、1min的程序运行↓↓↓探究2观察下图示意图，理解DNA复制过程由此可见，在PCR反应中，DNA聚合酶从引物的_________端开始延伸DNA链，所以DNA的合成方向总是从子链的________端向______端延伸。3′5′3′探究3结合教材，完成DNA分子的测定(1)配制二苯胺试剂：分别配制A液(1.5g___________溶于100mL冰醋酸中，再加入1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存)和B液(体积分数为0.2%的乙醛溶液)。将0.1mLB液加入10mLA液中，混匀。(2)取一定量的扩增前和扩增后的溶液分别放入两支试管中，加入等量的___________试剂，混匀后观察溶液的颜色。用___________加热上述溶液。在加热过程中，随时注意试管中溶液颜色的变化。二苯胺二苯胺沸水浴蓝色(3)根据___________的深浅，可以粗略地比较扩增前和扩增后溶液中DNA的含量是否有变化。(1)试概括PCR技术原理。提示：在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似。PCR技术利用了DNA的热变性原理。(2)如何判断DNA片段的扩增是否成功？提示：既可用二苯胺试剂来粗略的比较扩增前和扩增后DNA含量的变化，也可以采用紫外分光光度法或琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。1．DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。PCR中，引物长度通常为20～30个核苷酸。2．当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到55℃左右时，引物与模板可结合，一般不需要考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因是：①模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合；②引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会；③加入的引物的量足够大，而模板链数量少。3．实验操作的注意事项(1)PCR所用的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。(2)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，取液器上的枪头必须更换。(4)PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。(5)PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。突破1PCR实验操作1．PCR实验中使用