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第三章酶的应用技术实践第二节固定化酶的制备和应用第三章酶的应用技术实践学习导航明目标、知重点难点固定化酶和固定化细胞的应用。(重点)固定化酶与固定化细胞的制备方法。(难点)一、阅读教材P63分析固定化酶1．概念：是指用物理学或化学的方法将酶与___________结合在一起形成的仍具有___________的酶复合物。2．优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物___________，可被___________使用，且保持了酶的催化性能，可实现酶促反应的连续化和自动化。固相载体酶活性分离反复物理吸附法化学结合法3．制备固定化酶的常用方法目前，制备固定化酶的方法主要有___________、___________、包埋法等。二、阅读教材P64～65分析固定化细胞技术的应用1．应用：固定化细胞可以取代___________的细胞进行发酵，生产各种物质。2．优点(1)固定化细胞技术无须进行___________________，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成本。(2)固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的___________完成一系列的催化反应。游离酶的分离和纯化复合酶系(3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的_________更高。(4)细胞生长停滞时间短，___________等。3．缺点(1)固定化细胞只能用于生产___________和其他能够分泌到细胞外的产物。稳定性反应快细胞外酶(2)由于___________的影响，营养物质和产物的扩散受到一定限制。(3)在___________发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。载体好氧性4．酵母菌细胞的固定化技术的主要流程准备各种实验药品和器材↓制备___________↓___________酵母菌细胞↓麦芽汁活化凝胶珠配制物质的量浓度为0.05mol/L的氯化钙溶液↓制备固定化细胞↓浸泡___________，用蒸馏水洗涤↓发酵麦芽汁判一判(1)酶在催化时会发生变化，不可反复利用。()(2)某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应。()(3)固定化细胞所固定的酶都在细胞外起作用。()(4)制备固定化细胞的方法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法。()××××连一连固定化酶技术由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。人们针对酶的这种不足寻着改善的方法之一是固定化酶技术的应用。结合教材P63内容完成以下探究。(1)图A为___________，它的显著特点是___________且条件___________，在生产实践中应用广泛。(2)图B为___________，它是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成___________，从而得到三维的交联网架结构。物理吸附法工艺简便温和化学结合法共价键(3)包埋法是将酶包埋在_______________中。将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等___________中(如图C)，包埋成___________型；或包裹在___________等半透性高分子膜中(如图D)，包埋成___________型。能固化的载体高分子凝胶格子硝酸纤维素微胶囊各种固定化酶方法的比较物理吸附法包埋法化学结合法制备易较难较难结合程度弱强强活力回收率高，但酶易流失高中等再生可能不可能不可能固定化成本低低中等底物专一性不变不变可变突破1固定化酶的各种固定方法1．下图是酶的几种固定方式示意图，其所采用的固定方法依次是()A．物理吸附法、化学结合法、包埋法B．化学结合法、物理吸附法、包埋法C．包埋法、物理吸附法、化学结合法D．包埋法、化学结合法、物理吸附法解析：选D。①图表示酶包埋在细微网格里，应属包埋法；②图表示许多酶分子通过特殊载体连接起来，成交联网状结构，应属化学结合法；③图表示将酶固定在一定的支持物上，可用物理吸附法。突破2固定化酶特征2．下图中符合固定化酶特征的是()解析：选D。固定化酶技术是利用物理或化学的方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。固定化酶优点是使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被反复利用，在装置中酶是固定不动的，反应物是动的。判断固定化酶的方法固定化酶技术是利用物理或化学的方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。所以识别固定化酶的方法是观察酶是否固定不动，若是则属于固定化酶，否则不属于固定化酶。固定化细胞技术及酵母菌细胞的固定化技术固定化细胞在环境保护、能源开发等领域都有重要的应用。结合教材P64～65内容完成下面酵母菌细胞的固定化操作流程，理解细胞固定化过程。准备各种实验药品和器材主要药品有：干麦芽粉、干酵母、聚乙烯醇↓(PVA)、海藻酸钠、无水氯化钙、蒸馏水、葡萄糖溶液、碘液制备麦芽汁干麦芽粉＋___________――→_______℃放置3～4h麦芽汁――→煮沸、冷却、调pH灭菌无菌麦芽汁蒸馏水58～65↓活化酵母菌细胞干酵母＋_________→活化的酵母菌↓配制氯化钙溶液___________＋蒸馏水↓制备固定化细胞聚乙烯醇(PVA)＋___________＋蒸馏水――→加热、冷却加入酵母菌培养液酵母菌—聚乙烯醇—海藻酸钠溶液――→滴入氯化钙溶液中___________蒸馏水无水氯化钙海藻酸钠凝胶珠蒸馏水↓浸泡凝胶珠，用蒸馏水洗涤待凝胶珠在溶液中浸泡30min后，取出↓并用___________洗涤3次备用发酵麦芽汁将凝胶珠加入无菌麦芽汁中1．制备固定化酵母菌细胞的注意事项(1)选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一。(2)酵母菌细胞活化时体积会变大，因此活化前应选择体积足够大的容器，防止酵母菌细胞的活化液溢出。(3)海藻酸钠溶液的配制是固定化酵母菌细胞的关键，因为如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠，如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞的数量少，也会影响实验效果。(4)溶化海藻酸钠时要用小火间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊。(5)将溶化后的海藻酸钠先冷却至室温，再与酵母菌细胞混合，避免高温杀死酵母菌。(6)固定化酵母菌细胞时，应将酵母菌—聚乙烯醇—海藻酸钠溶液用注射器缓慢滴加到氯化钙溶液中，而不是注射，以免影响凝胶珠的形成。2．直接使用酶、固定化酶、固定化细胞的比较直接使用酶固定化酶固定化细胞酶的种数一种或几种一种一系列酶制作方法化学结合法固定化、物理吸附法固定化包埋法固定化是否需要营养物质否否是直接使用酶固定化酶固定化细胞催化反应单一或多种单一一系列反应底物各种物质(大分子、小分子)各种物质(大分子、小分子)小分子物质缺点①对环境条件非常敏感，易失活；②难回收，成本高，影响产品质量不利于催化一系列的酶促反应反应物不易与酶接触，尤其是大分子物质，反应效率下降直接使用酶固定化酶固定化细胞优点催化效率高、耗能低、低污染①既能与反应物接触，又能与产物分离；②可以反复利用成本低、操作容易突破1制备固定化酵母菌细胞1．下面的流程图表示制备固定化酵母菌细胞的过程，请据图回答：酵母菌细胞活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合→固定化酵母菌细胞(1)酵母菌活化前应选择足够大的容器，因为酵母菌细胞活化时________________。(2)影响此实验成败的关键步骤是________________。此步的操作应采用________________。(3)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞数目________________。(4)观察凝胶珠的颜色和形状：如果颜色过浅，说明_________________________________________________；如果形成的凝胶珠不是________________，说明海藻酸钠的浓度偏高，实验操作失败。(5)本实验所用的固定化技术是________，而制备固定化酶则不宜用此方法，原因是______________________。解析：(1)酵母菌在干燥时，处于休眠状态，需加水活化，活化后的酵母菌细胞体积增加。(2)该实验的关键是海藻酸钠溶液的配置。(3)如果海藻酸钠的浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞的数量过少，影响实验效果。(4)如果制作的凝胶珠颜色过浅呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低。如果形成的凝胶珠不是球形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。(5)由于酵母菌细胞个体较大，不易从包埋材料中漏出，故细胞的固定化一般采用包埋法，而固定化酶不宜用此方法。答案：(1)体积增加较大(多)(2)配制海藻酸钠溶液小火间断加热(3)较少(4)固定的酵母菌细胞数目较少球形或椭圆形(5)包埋法酶分子很小，容易从包埋材料中漏出检验凝胶珠的质量是否合格的方法(1)用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，且没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。(2)在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。突破2固定化技术的比较2．下列叙述不正确的是()A．从操作角度来考虑，固定化细胞比固定化酶更容易B．固定化细胞比固定化酶对酶活性的影响更小C．固定化细胞固定的是一种酶D．将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应选择固定化细胞技术解析：选C。固定化细胞内酶的活性基本没有损失，保留了细胞内原有的多酶系统，所以固定化细胞不同于固定化酶，它能固定多种酶。选择固定化酶与固定化细胞的方法(1)根据固定方法选择①固定化酶技术：由于酶分子较小，可以采用物理吸附法和化学结合法进行固定，它催化的是单一的化学反应。②固定化细胞技术：细胞一般体积较大，适合应用包埋法固定，而且细胞能够产生多种酶，因此固定化细胞可以催化一系列化学反应。(2)根据反应液中加入物质选择①在固定化酶应用过程中，反应溶液中只需要加入酶的底物。②固定化细胞在应用过程中，要保持细胞的正常生命活动，反应溶液中除需要加入反应的底物外，还应加入满足细胞生命活动所需的营养物质等。(3)根据反应的特点选择①固定化酶可以催化的反应物是小分子或大分子。②固定化细胞则只能催化小分子反应物。核心知识小结[网络构建]核心知识小结[关键语句]固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体．．．．结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。制备固定化酶的方法主要有物理吸附法、化学结合法．．．．．、包埋法．．．等。在固定化细胞技术中，从操作角度考虑，包埋．．法更容易；固定化细胞对酶活性的影响小；如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应选择固定化细胞的方法；如果反应物是大分子，应选择固定化酶．．．．方法。本部分内容讲解结束按ESC键退出全屏播放