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淋巴细胞抗原识别受体的编码基因及受体多样性的产生1.TB细胞都用其抗原识别受体识别抗原B细胞：Bcellreceptor(BCR)T细胞：Tcellreceptor(TCR)淋巴细胞抗原识别特点：2.一种淋巴细胞仅表达一种抗原受体究竟什么样的病原微生物能够突破机体的天然免疫屏障并不能预料。为了能够防御所有可能的病原微生物的感染，特异性免疫应答系统必须能够识别所有可能的外来抗原物质，因此BCR和TCR必须形成一个巨大的抗原受体库。问题：为什么人产生的抗体比他自身携带的总的基因数还要多？人可以表达的抗原受体约为1012个，人的基因总数仅为3－5万个。内容：一、BCR重排的发现及BCR胚系基因结构二、产生BCR多样性的机制三、BCR基因表达的一些特点四、TCR的基因结构和多样性的产生一、BCR重排的发现及其胚系基因结构BCR或抗体由可变区和恒定区组成，其多样性是由可变区决定的。可变区多样性是怎样产生的?抗体多样性的两种假说：体细胞突变假说B细胞发育过程中发生了突变，导致生成的BCR或者抗体变成许多种基因片段重排假说Dreyer和Bennett于1965年提出，即两个基因一条多肽链理论。他们认为BCR由两类基因片段组成，一类编码BCR的V区，一类编码BCR的C区。V区基因含有多个基因片段，只有其中一个片段与C区形成抗体。？Tonegawa的设想：XXXXXX限制性内切酶酶切位点BCR胚系基因经过重排的基因重排现象的实验证明对小鼠胚系DNA和骨髓瘤细胞V和C基因的DNA做序列分析，发现在重排后的V区和C区基因不是直接拼接在一起的，由此发现了J(joining)基因片段和D（diversity）基因片段。“ForhisdiscoveryofthegeneticprincipleforgenerationofantibodydiversityMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)Cambridge,MA,USATheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1987SusumuTonegawa（利根川进）b.1939人免疫球蛋白胚系基因图l轻链基因位于22号染色体上，k轻链基因位于2号染色体上，重链基因位于14号染色体上。V区基因和C区基因。V、D、J基因片段。信号肽L(leader)将各条肽链导入内质网腔后被切去。小结：•抗体或BCR的多样性是由它们的可变区决定的•引起抗体多样性的基因重排假说和体细胞突变假说•基因重排假说的证实•J和D基因片段的发现•胚系免疫球蛋白的基因结构二、产生BCR多样性的机制(1)多样性机制之一：基因片段的重排每条编码轻链和重链可变区的基因都由数个基因片段组成。k链：40（Vk）x5（Jk）=200个Vkl链：30（Vl）x4（Jl）=120个Vl重链：65（VH）x27（DH）x6（JH）=11000个VH基因片段重排方式：12/23规则(12/23rule)重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS):七核苷酸－12/23核苷酸的随机序列－九核苷酸V区基因的重组由几种V(D)J重组酶协调完成，负责剪切和连接工作。包括RAG－1和RAG－2异二聚体组成的内切酶、TdT、DNA连接酶IV，DNA－PK、Ku。k链：40（Vk）x5（Jk）=200个Vkl链：30（Vl）x4（Jl）=120个Vl重链：65（VH）x27（DH）x6（JH）=11000个VH理论上将产生11000x(200＋120)=3.5x106个不同抗原特异性的抗体，实际上要少一些。因为并不是所有的V基因都以同样频率使用，并不是所有的轻链重链配对都能成功。（2)多样性机制之二：重链轻链随机组合（3）多样性机制之三：基因片段结合处的变化仅仅通过基因重排和随机组合，理论上只能产生3.5x106个不同抗原特异性的抗体，实际上抗体的数目要远远多于这个数字。为什么CDR3高变区变化最大呢？抗体多样性主要由CDR体现，其中CDR3在三个高变区中的变化最大。CDR1和CDR2由V区基因编码，CDR3在轻链中是由V基因片段和J基因片段的连接处编码的，在重链中是由D基因编码的。对重排后的基因和胚系基因的核苷酸序列进行测定，发现V（D）J不是准确地连在一起的，在连接时增加和减少数个核苷酸，连接多样性(junctiondiversity)。核苷酸在连接处的增加或者减少常常导致DNA的读框受到破坏，产生没有功能的抗体。（4）多样性机制之四：体细胞高突变（SomaticHypermutation,SHM)纯系三组BALB/c小鼠免疫抗原后对特异性抗体可变区的序列分析抗体的亲和力成熟(affinitymaturation)小鼠和人类的SHM的频率是10-5至10-3，比其他基因的自发突变高1百万倍。SHM在抗体的可变区发生需要AID（Activation-inducedcytidinedeaminase）cytosineuracilAIDSHM的机制uracil-N-glycosylase（UNG)除去dU，Mismatchrepair(MMR)蛋白识别错配碱基，Error-proneDNApolymerases修复，导致突变（在胞嘧啶位置或相邻位置）dC:dG形成dU:dG错配SHM的发生重排和高突变的发育控制重排：抗体基因片段在与抗原无关的情况下装配起来，这样的抗体对抗原具有低亲和力。体细胞突变：一旦抗原被找到了，对该抗原具有低亲和力的B细胞就会发生体细胞突变，形成高亲和力的B细胞。问题：为什么免疫系统要用两种机制改变体细胞使抗体增加多样性？微生物和它们的分泌物是免疫系统的主要防御对象。因为微生物生长速度比脊椎动物快许多倍，因此微生物产生突变体的速度可以很快，如果免疫球蛋白仅是由胚系基因编码的，那么脊椎动物就无法对付抗原飞速的变化，体细胞多样性使得机体不受限制地产生抗体。（5）多样性机制之五：类别转换（isotypeswitch）B细胞恒定区的基因在B细胞成熟后仍然改变。所有的B细胞最开始都表达IgM，之后表达的抗体可以是IgG，IgA和IgE，这种变化叫做类别转换。轻链不产生类别转换。免疫球蛋白C区基因:200kb长。每个C区基因又分成几个外显子，每个外显子表达一个恒定区功能域。表达IgM和IgD的B细胞没有经过类别转换，它们只是RNA选择性剪切的结果。类别转换的过程：转换序列（switchsequence或者switchregion）ClassSwitchRecombination（CSR）类别转换需要T细胞和细胞因子参加CSR和SHM都在B细胞的中心母细胞阶段发生SHM和CSR使用不同的一组酶SHM：AID（氨基末端）CSR：AID（羧基末端），Ku，DNA-PKcs，H2AXCSR也需要AID参与类别转换与V区基因重组不一样。第二，类别转换仅仅引起抗体的类别而不是特异性变化；第三，类别转换在B细胞受到抗原激活之后产生，而不是在B细胞发育过程中产生；第四，类别转换不是随机的，而是由T细胞调节的。第一，所有类别转换的产物都是具有功能的；抗体多样性的产生基因重排体细胞突变类别转换细胞阶段未成熟细胞成熟细胞成熟细胞发生地点骨髓生发中心生发中心抗体部位可变区可变区恒定区多样性的产生小结：•抗体可变区的多样性由四个主要原因决定：VJ或VDJ基因片段重排；轻链重链随机组合；基因片段结合处的变化；体细胞突变。•B细胞的类别转换导致可变区相同恒定区不同的抗体。•胚系基因具有重组信号序列。基因重排时遵循12/23规则由V(D)J重组酶帮助完成重排。•体细胞基因重排发生在B细胞接触抗原之前，产生的抗体亲和力低。体细胞突变发生在B细胞接触抗原之后，产生的抗体亲和力高。三、BCR基因表达的一些特点（1）等位排斥(allelicexclusion)：一个B细胞只表达一种BCR同种型排斥（isotypeexclusion）：一个B细胞只表达一种轻链。B细胞发育过程中轻链重链的重排过程：轻链会发生反复重排，重链不发生反复重排每个等位基因基本以相等的比例表达，没有哪个等位基因优先的倾向，先重排的基因先表达。k和l轻链比例在不同种属中差异很大。人是65:35，小鼠95:5，猫与鼠相反。（2）膜型Ig和分泌型Ig小结：•B细胞在发育过程中产生等位排斥和同种型排斥现象，结果一个B细胞只表达一种BCR或分泌一种抗体。•所有免疫球蛋白都有跨膜型（BCR）和分泌型（抗体）两种。四、TCR的基因结构和多样性的产生BCR和TCR都是识别抗原，那么TCR的基因结构和多样性的产生究竟是否和BCR相似呢？（1）TCR和BCR的相似之处TCR结构类似免疫球蛋白，与免疫球蛋白有30-35%同源性。与BCR一样，两种TCR都含可变区和恒定区。TCR结构与免疫球蛋白的Fab类似TCR的基因的组成方式与免疫球蛋白基因基本一样。a链和g链基因类似轻链，有V和J基因片段。b链和d链基因类似重链，有VDJ基因片段。TCR的胚系基因结构（b,g链基因在第7号染色体上，a,d链基因在第14号染色体上）TCR也是通过体细胞重排变为多样性的TCR的重排的机制与免疫球蛋白一样，也具有7核苷酸和9核苷酸的重组识别信号，并遵守12/23碱基规则。TCR也存在着等位排斥现象（2）TCR和BCR的区别Va类似免疫球蛋白轻链的VJ基因产物，Vb类似重链的VDJ基因产物。其折叠方式类似免疫球蛋白Fab片段。但是TCR的Ca不具备免疫球蛋白的折叠方式。TCR也具有连接多样性。因为TCR具有更多的J基因片段和更多的N区插入，TCR在连接处的变化更大。编码TCRb链的D基因片段有两处，这样会增加其有效重排的机会编码a链的J基因片段有多个，也会增加有效重排的机会TCR没有分泌形式，总是膜蛋白TCR最大的不同于BCR的地方是它不产生体细胞突变。为什么？T细胞仅是识别细胞结合的抗原。这些抗原局部浓度很高，不需要T细胞的亲和力通过体细胞突变增加。成熟的T细胞不能识别自身抗原，而体细胞突变后可能会产生自身反应性。和B细胞不一样，自身反应的T细胞可以直接引起疾病，因此T细胞不应该通过体细胞突变。小结：TCR在很多方面与BCR非常相似，也是通过体细胞重排变为多样性的，其重排机理与BCR一样。不过TCR和BCR也有许多不同之处。二者最大的不同是T细胞不发生体细胞突变，由此避免了由体细胞突变产生自身反应性T细胞。重点：•BCR和TCR的胚系基因结构•产生BCR和TCR多样性的机制和区别•等位排斥、类别转换、膜与分泌型抗体增加的核苷酸称为P-核苷酸（回文序列，palindromicsequences)和N-核苷酸（非模板合成）。人免疫球蛋白胚系基因图类别转换的过程：LiZetal.GenesDev.2004;18:1-11转换序列（switchsequence或者switchregion）