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1第七章基因结构与表达分析的基本策略StrategyforStructureandExpressionAnalysesofGenes主讲人：罗志勇教授21.DNA双螺旋结构发现（Watson＆Crick,1953）概论TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine19623PresentationSpeechbyProfessorA.EngströmDr.FrancisCrick,Dr.JamesWatson,Yourdiscoveryofthemolecularstructureofthedeoxyribonucleicacid,thesubstancecarryingtheheredity,isofutmostimportanceforourunderstandingofoneofthemostvitalbiologicalprocesses.Practicallyallthescientificdisciplinesinthelifescienceshavefeltthegreatimpactofyourdiscovery.Theformulationofdoublehelicalstructureofthedeoxyribonucleicacidwiththespecificpairingoftheorganicbases,opensthemostspectacularpossibilitiesfortheunravellingofthedetailsofthecontrolandtransferofgeneticinformation.4CentralDogma2.中心法则提出（Crick，1958）Crick,1916-20045反转录机制阐明（Temin1970）补充的中心法则6中心法则：代表了大多数生物遗传信息贮存和表达的规律，奠定了从分子水平研究生命科学关键问题的理论基础。73.基因表达（geneexpression）：从DNA到蛋白质，通过转录和翻译，用基因的遗传信息在细胞内合成有功能意义的各种蛋白质。84.基因结构与表达分析技术：Northernblot※Real-timeRT–PCR※基因芯片DNA序列分析※Southernblot※FISHDNARNAWesternblot※蛋白质芯片蛋白质9讲授内容：(Ⅰ)DNA序列分析※(Ⅱ)核酸分子杂交※(Ⅴ)聚合酶链式反应※(Ⅲ)基因芯片和微阵列(Ⅳ)Western免疫印迹※10（一）双脱氧链末端终止法※(Sanger,1977)（二）化学裂解法(Maxam＆Gilbert,1977)（三）DNA自动化序列分析一、DNA序列分析11DNA测序技术基础：●高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）技术●PAGE能分离长度为300-500个碱基,差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。12(Sanger,UKMaxam＆Gilbert,USA)共同分享Nobel化学奖(1979)13(一）双脱氧链末端终止法（dideoxychaintermination）以DNA合成反应为基础。(Sanger)14ATP、dATP和ddATP的结构ATPdATPddATP15DNA合成反应掺入N个核苷酸掺入N+1个核苷酸161.双脱氧末端终止法原理DNA合成反应中，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5′-P端形成3′，5′-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP。17末端终止部位DNA单链模板引物延伸的新合成链掺入ddNTP182.DNA测序主要步骤●变性聚丙烯酰胺凝胶电泳●单链DNA模板的制备●DNA模板与测序引物退火●掺入法标记反应●延伸-终止反应●放射自显影●阅读测序结果19测序步骤2021G反应管A反应管C反应管G反应管T反应管22GATC23与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础上。（二）化学裂解法24将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记，标记的DNA片段分成四个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种碱基处断裂。1.化学裂解法原理25化学降解G反应模式图硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet26（三）DNA测序自动化原理采用4种不同的荧光分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。271.DNA自动测序步骤：4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPsSanger测序反应反应产物毛细管电泳分离28荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序。激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光292.DNA自动测序结果30(Ⅱ)核酸分子杂交NucleicAcidHybridization31●细胞原位杂交（Pardueetal，1969)●Southern印迹杂交※:检测DNA（SouthernEM，1975）●Northern印迹杂交※:检测RNA（StarkGR，1977）核酸分子杂交技术的建立32核酸分子杂交原理标记的单链核酸探针与待检测的靶单链DNA或RNA局部互补结合形成杂交双链。应用：核酸靶DNA或RNA序列的定性与定量分析。3334一、Southern印迹杂交(Southernblothybridization)将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。35PaperTowelsSouthernBlotting1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHSpin36AgaroseGelElectrophoresis_+337二、Northern印迹杂交(Northernblothybridization)指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。38RNA琼脂糖凝胶电泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblothybridization28S18S应用举例39GAPDH0d2d4d6d8dNorthernblot杂交分析mRNA的表达靶mRNA40三、其他杂交技术(一)斑点杂交(dotblothybridization）:将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。●●●●●●41（二）原位杂交（insituhybridization）用标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序列杂交，可对核酸进行定性、定位和相对定量分析。42（三）液相杂交(solutionhybridization)1．核酸酶S1保护分析法(nucleaseS1protectionassay）单链DNA探针与待测RNA形成DNA/RNA杂交双链，加入核酸酶S1专一性地降解未形成杂交体的DNA或RNA单链，DNA/RNA杂交双链则受到保护而不被降解。432．RNA酶保护分析法（RNaseprotectionassay，RPA）44RPA基本程序：●待测RNA的分离●体外转录标记RNA探针●待测RNA与探针RNA进行液相杂交●RNA酶消化●不同大小杂交片段凝胶电泳分离453.抑制消减杂交原理（suppressionsubtractivehybridization，SSH）以杂交为基础，并与PCR技术结合的cDNA消减杂交方法。应用：差异表达新基因的筛选与克隆。46SSH原理47cDNAChipandMicroarray(Ⅲ)基因芯片和微阵列48●基因芯片上的阵列是由有规则排列的cDNA或寡核苷酸等样本所组成的。●基因表达高通量分析法。49DNA微阵列：●cDNA微阵列（cDNAmicroarray）●寡核苷酸微阵列（oligomicroarray）50cDNA微阵列:在一微小的基片（硅片等）表面集成了大量分子识别探针，能够平行分析大量基因转录表达，因此又被称为cDNA芯片。51基因表达谱芯片主要技术流程：样品荧光标记芯片制备芯片杂交芯片洗涤和扫描扫描图像分析10252核酸杂交技术和微阵列芯片克隆DNAcDNA标记阵列(Array,Macroarray)杂交、显影高密度微阵列(Microarray)10353CBACy5-标记cDNACy3-标记cDNACBACBACBACBACBACBA样品1样品2Cy5/Cy3荧光标记RNA提取•竞争性杂交显示•基因表达量差异二种样品竞争性杂交示意图基因表达谱芯片的原理10454生物学问题提出，表达基因分析，样本分类与实验预测.实验设计基因芯片实验图象分析结果标准化基因表达谱芯片研究应用思路10555某些基因表达异常或存在差异生物学确证和解释分析下一步实验设计56●cDNA芯片可定量监测大量基因表达水平，阐述基因功能，探索疾病原因及机制、发现诊断及治疗靶基因等。cDNA芯片在医学中的应用●Northernblot或RT-PCR验证。●基因表达数据的生物信息学分析。57(Ⅳ)Western免疫印迹Westernblot原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。5859Westernblot程序：●蛋白质样品制备●SDS-PAGE分离●蛋白质转膜●标记抗体与膜上蛋白质抗原杂交●检测并分析标记物信号60Western免疫印迹信号检测原理61Luminol化学发光原理62另一种信号显示方法是在洗去一抗后，加入碱性磷酸酶标记的二抗，再用BCIP／NBT在膜上直接显色。63免疫沉淀技术是一种抗原抗体反应技术，只是将抗体分子先结合到固相载体如磁珠上，然后与含目标蛋白的细胞裂解液进行液相杂交反应，利用磁场或离心等技术将结含在抗体上的蛋白质收集起来，电泳分离，用于Westernblot分析。64(Ⅴ)聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction65引言●PCR技术发明（1985，MullisK.）●PCR及其相关技术发展速度惊人、应用迅速广泛（分子生物学、医学、生物学、考古学等学科领域）●获Nobel化学奖（1993，MullisK.）66讲授内容提要:一、PCR技术原理二、耐热DNA聚合酶三、PCR引物及设计原则四、PCR条件的优化五、PCR改进技术67聚合酶链式反应(PCR):一、PCR技术原理MullisK.1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。TheNobelPrizeinChemistry199368DNA复制●半保留复制●半不连续复制●冈崎片段领头链随从链69引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸DNA或RNA片段。DNA复制引物：单链RNA片段PCR引物：单链DNA片段70（一）PCR基本过程1.PCR循环由三步组成：①变性（denaturation）②退火（annealing）③延伸（extension）71PCR原理低温退火高温变性中温延伸72在模板DNA、引物、4种dNTP存在条件下，依赖DNA聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。2.PCR定义：733.PCR扩增终产物大小:介于两条退火引物5′末端之间的双链DNA片段。744.什么叫引物延伸产物？比两引物限定区长的延伸产物。仅发生在以原始模板DNA为模板的扩增过程中，以倍数形式扩增(2n)。75Y=A（1+E）nY:扩增产物的量A:最初靶DNA分子数E:PCR扩增效率n:循环次数5.PCR产量当E＝100％,A=1时Y=2n2n(引物延伸产物的量）76PCRthermalcyclerRotor-Gene77PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析78（二）平台期与平台效应1.平台效应（plateaueffect）：PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入静止期即平台期。79PCR平台效应802.平台期影响因素：①引物及dNTP底物浓度降低。②酶与模板比例下降。实际应用提示：定量PCR应考虑平台期效应，