大小型层析柱的装填实践介绍(中文)

TOSOHBIOSCIENCEGmbHA.Sprauer–5/06TOYOPEARL树脂填料大小型工业制备色谱柱的装填实践GötecPallGEHealthcarePall-Euroflow/ResoluteTOSOHBIOSCIENCEGmbHTOYOPEARL树脂填料的装填装填前的准备工作–小颗粒的去除–缓冲液平衡–匀浆准备装填步骤/层析柱类型层析柱的操作–柱子的平衡与柱效评价–保存内容提要PeakBiotechTOSOHBIOSCIENCEGmbH装填的一般原则☆TOYOPEARL的装填压力最好在0.5-5bar的范围内☆装填流速至少比实际操作流速高50%☆不要使用会产生剪切力的装置（如：磁力搅拌器、齿轮泵）-这些装置会磨碎树脂填料并产生小颗粒☆TOYOPEARL是一种刚性强的树脂填料，装填时务必区别于一般的软式琼脂糖凝胶Superformance/GötecTOYOPEARL树脂填料的装填TOSOHBIOSCIENCEGmbH基本步骤去除小颗粒装填缓冲液平衡匀浆准备装柱TOYOPEARL出货时为悬浮液状态（含20%乙醇）TOYOPEARL树脂填料的装填TOSOHBIOSCIENCEGmbH装柱前务必进行小颗粒去除的操作!•小颗粒的存在会阻塞筛板或烧结板，并最终会导致整个柱子的压降增大小颗粒的去除采取悬浮静置移注法重复这一步骤不少于3次借助显微镜可检查小颗粒的存在小颗粒的去除TOSOHBIOSCIENCEGmbHTOYOPEARL粒径CoarseC级规格:100µmMediumM级规格:65µmFineF级规格:45µmSuperfineS级规格:35µm水中静置时间15-30Min.30-45Min.45-60Min.60-90Min.AmiconModuline-120cmID显微镜微观显示–Toyopearl650MTOYOPEARL的静置时间TOSOHBIOSCIENCEGmbH在去除小颗粒时的最后一次步骤中可加入装填缓冲液进行填料的平衡最好根据实际生产中所使用的缓冲液选取合适的装填缓冲溶液一般来讲，分离纯化工艺中将使用到的最高离子强度的流动相是装填缓冲液的首选–这一操作可以将填料装得最为紧密，并且可以防止死体积的发生或胶体内沟槽的出现。装填缓冲液的平衡TOSOHBIOSCIENCEGmbHSECHW-40,HW-50,HW-55,HW-65andHW-75IECDEAE-650,QAE-550C,Super-Q-650,CM-650,SP-550C,MegaCapIISP-550ECandSP-650HICEther-650,Phenyl-650,PPG-600m,Butyl-650,SuperButyl-550CandHexyl-650cAFCAF-TresylandAF-Epoxy-650MAF-Formyl-650M,AF-Amino-650MandAF-Carboxy-650MAF-HeparinHC-560MAF-Chelate-650MAF-BlueHC-650M,AF-Red-650M0.1MNa2SO4,NaNO3,orNaCLin50mMphosphateorTrisbuffer.OrganicsolventsmaybeappliedtoHW-40asadsorptionchromatographylikeSephadexLH-20.1MNaClin50mMphosphate,Tris,oracetatebuffer2MNa2SO4or(NH4)2SO4in50mMphosphatebuffer0.5MNaClin0.1MNaHCO3orphosphatebuffer1MNaClin100mMphosphateorNaHCO3buffer2MNaClin20nMphosphatebuffer0.5MNaClor0.2Mglycinein20mMphosphateorTrisbuffer2MKCIorNaClin20mMphosphateTOYOPEARL-典型的装填缓冲溶液TOSOHBIOSCIENCEGmbH利用量筒测量静置胶体体积或使用水泵抽滤浆液至湿滤饼后计算装填所需要的填料体积通过添加装填缓冲液调节浆液浓度:-流动式装填柱~40-70%(v/v)-自动装填柱20-60%(v/v)最终装填好的柱床体积是要小于装填前胶体静置体积或抽干的湿滤饼的体积SlurrypreparationinthecolumnSlurrypreparationinaseparatetankSettlingresinAmiconModuline-120cmID匀浆准备TOSOHBIOSCIENCEGmbHToyopearlHW-40,HW-50,HW-55HW-65andHW-75FEther-650,Phenyl-650Butyl-650,DEAE-650Super-Q-650,CM-650SP-650andallAffinityQAE-550CandSP-550C使用约1.1倍柱体积的静置胶使用约1.2倍柱体积的静置胶使用约1.25-1.4倍柱体积的静置胶对于给定的柱子，装柱所需的静置胶体积TOSOHBIOSCIENCEGmbHo恒流速装填法o恒压装填法o辅助的重力沉降装填法不同装填方法的特点装填方法恒流速恒压重力沉降装填速度快快慢流速范围可增大至较高可增大至较高只能慢操作重复性很好很好好泵恒速恒压蠕动泵压力计需要需要不需要主要装填方法TOSOHBIOSCIENCEGmbH方法简介:–将柱底筛板用装填缓冲液润湿（赶走气泡）–任何时候，均需确保浆液在注入层析柱前进行过匀浆操作–匀浆液倒入后，立刻将分配器置于储槽内浆液表面–分配器与溶液浆液间不应有气泡存在–阶段性调整装填流速至目标流速，以产生一个实时的、没有太大振动的栓塞流–在最初的压实操作基础上，为进一步压实柱床，至少泵入5-10倍柱体积的装填缓冲液–调整分配器至胶体表面–重复后两个步骤，直至柱床被彻底压实。最后将分配器移至距离柱床2-5mm处（最后一次）。不要担心使用分配器的同时进行柱床的压实操作！MilliporeQuikScaleFlowPackedColumns(Millipore-QuikScale+Moduline,GEHealthcare-BPG,Götec-Superformance,BioRad-Geltec,etc.)恒流速装填方法TOSOHBIOSCIENCEGmbH模式填料类型柱尺寸[cmIDxL]填料等级装填流速[cm/h]操作流速[cm/h]SECHW-40HW-50HW-55HW-65HW-752,2x602,2x602,2x602,2x602,2x60S(30um)F(45um)C(75um)S(30um)F(45um)S(30um)F(45um)S(30um)F(45um)F(45um)30–4060–80120–16025–3550–7025–3550–7020–7540–15040–15010–2525–5050–10010–2025–3510–2025–3510–1515–3015–30IECDEAE-650,SuperQ-650CM-650,SP-650SP-550,QAE-550MegaCapIISP-5502,2x202,2x202,2x20S(35um)M(65um)C(100um)C(100um)EC(100-300um)400–600800–1000800–1200700–1000800–120045–6580–13080–60080–24080–500HICEther-650,Phenyl-650,Butyl-650PPG-600,Butyl-600SuperButy-550,Hexyl-5502,2x202,2x202,2x20S(35um)M(65um)C(100um)M(65um)C(100um)400–600800–1000800–1200800–1000800–120045–6580–13080–50080–13080–500AFCAF-Amino-650,AF-Carboxy-650AF-Formyl-650,AF-Epoxy-650AF-Tresyl-650,AF-Chelate-650,AF-BlueHC-650,AF-Heparin-HC-650AF-Red-6502,2x10M(65um)800–100030–130实验室规模最优化的装填及柱操作流速TOSOHBIOSCIENCEGmbH柱尺寸(I.D.xL)2.2cmx60cm9cmx30cm25cmx30cm填料类型HW-55SQAE-550CDEAE-650M目标流速(ml/min)23002000增加量(ml/min)0.550500保持时间(min)0.522恒流速装填法中流速的增加量举例：恒流速装填方法TOSOHBIOSCIENCEGmbHGötec/Superformance20cmIDColumn气泡会由于切换阀、管路连接处、活塞运动、未脱气缓冲液而引起........恒流速装填方法-扰动（由入口处筛板下气泡而引起的）TOSOHBIOSCIENCEGmbH装填运行管路清洗卸料HorizontalFlow-“SelfPacker”-presetcolumnvolume(Pall/Euroflow-ResoluteTM,Millipore-IsoPakTM,GEHealthcare-Chromaflow,EasternRiver)优点：易于装填弱点：填料用量较大,卸料可能较难,有剪切力发生,卸料会导致大量的浆液体积Resolute恒压装填方法TOSOHBIOSCIENCEGmbHRadialFlow-“SelfPacker”-presetcolumnvolume(Proxcys-CRIO)oLowspacerequirements–only0,5~1m2;even600literBVismountedonwheelsoLargeinletsurfacearea–cotrolled&gentleproductapplication(“NaturalDistribution”).oThinfritkeepstheresintogether–itisnotusedasflowdistributor–abarrierofonly~60um–negligibleinfluenceonpressuregenerationIdenticalpathlengthforallsubstancesA-ECRIO601S5literBVCRIO-ColonneRadialeInOxidable恒压装填方法TOSOHBIOSCIENCEGmbHDynamicAxialCompression(Novasep,PeakBiotech,Technikrom,GEHealthcare)UnpackingPneumatic/HydraulicSlurrytransfer优点：装填操作简单，非常快缺点：卸料会导致大量的浆液体积(whilecolumnisassembled)；不易操作g(whiledisassemblingthecolumn),卸料缓慢PeakBiotech/DanProcess-DAC恒压或恒流速装填方法TOSOHBIOSCIENCEGmbH不要使用没有进行正确柱效评价的层析柱!!!–SEC、RPC及HIC型层析柱的柱效与装填质量密切相关的。–只有IEC和AFC型层析柱，在没有高塔板数时也能正常工作。尽管如此，对称性因子还是相当重要的。层析柱操作TOSOHBIOSCIENCEGmbH使用5-10倍柱体积的低离子强度缓冲液进行柱子的平衡使用低分子量、无保留的化合物进行柱效的测定（如：丙酮、盐）进样体积为柱体积的0.25-1%将测定而得的塔板数、不对称性因子与厂家提供的最小值相比较如果未达到最小塔板数等期望值，必须重新进行柱子的装填！可供选择的方法:使用高离子强度的装填缓冲液，使用低盐溶液或水进