免疫组化技术的原理及方法

免疫组织化学技术免疫组织化学技术的原理及方法的原理及方法北京友谊医院病理科北京友谊医院病理科黄受方黄受方免疫组织化学技术的原理及其方法免疫组织化学技术的原理及其方法一一..基本知识基本知识二二..基本原理基本原理三三..方法方法四四..结果的判断及异常着色原因分析和对策结果的判断及异常着色原因分析和对策生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物一、免疫组化技术的基本知识一、免疫组化技术的基本知识生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物一、一、免疫组化技术的基本知识免疫组化技术的基本知识nn免疫组化的基本概念免疫组化的基本概念利用抗原利用抗原--抗体特异性结合原理检测抗原或抗体抗体特异性结合原理检测抗原或抗体一般是用抗体检测抗原一般是用抗体检测抗原nn抗原抗原两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白质具有抗原性质具有抗原性nn抗体抗体与抗原能特异性结合与抗原能特异性结合——生物学结合是免疫球蛋生物学结合是免疫球蛋白白IgIg生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物(IgG(γγ),),IgA(IgA(αα))，，IgD(IgD(δδ),),IgE(IgE(εε),),IgM(IgM(μμ))五种免疫球蛋白只有两种类五种免疫球蛋白只有两种类型的轻连，即：型的轻连，即：Kappa(Kappa(κκ))和和Lambda(Lambda(λλ))每个抗体分子的轻链必须相同；每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗体分子某一单独的抗体分子决不可能既决不可能既有有κκ链又有链又有λλ链。这一点在免疫链。这一点在免疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。组化的淋巴瘤诊断中十分重要。生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物(FragmentFc(Fragmentcrystalline)crystalline)是免疫球蛋白的羧基端，意为是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片段，因其纯化时呈结晶结晶片段，因其纯化时呈结晶状态而名之，该片段与抗原特状态而名之，该片段与抗原特异性有关异性有关nnFab(FragmentFab(Fragmentantigenantigenbingdingbingding))该端是抗体与抗原特异性结合该端是抗体与抗原特异性结合的部位，每分子的部位，每分子IgIg能结合能结合22个抗个抗原分子原分子FFccFFababAAgg生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物多克隆抗体：多株多克隆抗体：多株BB细细胞针对多个抗原决定胞针对多个抗原决定簇产生的抗体簇产生的抗体nn单克隆抗体：针对某单克隆抗体：针对某一抗原决定簇，由单一抗原决定簇，由单株淋巴细胞（克隆）株淋巴细胞（克隆）所产生的抗体所产生的抗体多克隆抗体单克隆抗体生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。nn常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目录上常以录上常以RaHRaH（（RabbitagainstHumanRabbitagainstHuman）表之。）表之。nn多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用至关重要。至关重要。生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物多克隆抗体与单克隆抗体及其产生多克隆抗体与单克隆抗体及其产生单克隆抗体的产生单克隆抗体的产生应用细胞融合的杂交瘤技术应用细胞融合的杂交瘤技术（（HybridizationHybridization），以针对单），以针对单一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细胞（肿瘤性髓瘤细胞（肿瘤性BB细胞）融合细胞）融合形成杂交瘤，其特点是既能产形成杂交瘤，其特点是既能产生特异性抗体，又能在体外无生特异性抗体，又能在体外无限地增殖。将瘤细胞在体外培限地增殖。将瘤细胞在体外培养或注入小鼠腹腔内而获单克养或注入小鼠腹腔内而获单克隆抗体，由此产生的小鼠抗人隆抗体，由此产生的小鼠抗人（抗原）的抗体常以（抗原）的抗体常以MaHMaH表示，表示，现在亦有兔的单克隆抗体现在亦有兔的单克隆抗体生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物抗原的制备：抗原的制备：nn传统用蛋白提纯传统用蛋白提纯nn近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因结构，用其合成多肽，作为抗原，如结构，用其合成多肽，作为抗原，如ERER、、PRPR抗抗原的制备原的制备nn现有兔的单抗现有兔的单抗生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。nn单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体则敏感单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体则敏感性高，为何使用完全决定于使用的目的性性高，为何使用完全决定于使用的目的性生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如αα--胰蛋胰蛋白酶白酶nn有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。如测。如DesminDesmin来源于鸡的肌肉来源于鸡的肌肉nn近年来近年来,,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔源性源性生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到抗原抗体的结合能用肉眼观察到nn标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明酶：酶：辣根过氧化酶辣根过氧化酶，硷性磷酸酶，硷性磷酸酶金属离子：胶体金颗粒金属离子：胶体金颗粒nn标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性，从而使染色敏感性降低物的活性，从而使染色敏感性降低生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物酶酶——抗酶抗体复合物抗酶抗体复合物nn通过免疫反应而不是化通过免疫反应而不是化学方法，将酶结合到抗学方法，将酶结合到抗体上，形成具酶活性的体上，形成具酶活性的免疫复合物。如免疫复合物。如PAPPAP复复合物合物（（PeroxidasePeroxidaseAntiPeroxidaseAntiPeroxidaseComplexComplex）），，PAPPAP复合物复合物属非标记性，保护了酶属非标记性，保护了酶的活性，比免疫荧光法的活性，比免疫荧光法敏感上千倍。敏感上千倍。生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物亲和素亲和素——生物素复合物生物素复合物（（AvidinAvidin--BiotinComplexABCBiotinComplexABC））nn亲和素有四个生物素分子特异亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合荧光素等结合nn亲和素亲和素--生物素复合物是一个三生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性此生物反应的敏感性和特异性nnABAB复合物多用于复合物多用于ABCABC法的免疫法的免疫组化中组化中生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物酶标亲和素（酶标亲和素（LabelledLabelledstreptavidinstreptavidin））nn在在ABAB复合物中，酶是复合物中，酶是标记在生物素上，而标记在生物素上，而后与亲和素合成复合后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素物。在标记的亲和素--生物素方法中是将辣生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此极强的结合力，因此LSABLSAB法比法比ABCABC法更敏感法更敏感生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物一步法及二步法载体试剂，可分别称一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKOEPOSDAKOEPOS及及DAKOEnvisionDAKOEnvision试剂试剂nn核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用子，起到载体的作用nn一步法多聚物载体试剂是多聚物结