-1-EvaluationWarning:ThedocumentwascreatedwithSpire.Docfor.NET.第3讲基因工程[考纲展示]1.基因工程的诞生(Ⅰ)2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)3.基因工程的应用(Ⅱ)4.蛋白质工程(Ⅰ)考点一|基因工程的基本工具1.基因工程的概念(1)概念:按照人们的愿望,进行严格的设计,并通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。(2)优点①与杂交育种相比:克服了远缘杂交不亲和的障碍。②与诱变育种相比:定向改造生物的遗传性状。2.基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。①来源:主要来自原核生物。②特点:具有专一性,表现在两个方面:识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。切割——特定核苷酸序列中的特定位点。③作用:断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。④结果:产生黏性末端或平末端。(2)DNA连接酶种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点缝合黏性末端缝合黏性末端和平末端作用缝合双链DNA片段,恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键(3)载体①种类:质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。②质粒的特点能自我复制有一个至多个限制酶的切割位点有特殊的标记基因③运载体的作用:携带外源DNA片段进入受体细胞。-2-[思考回答]1.(1)原核生物中限制酶为什么不切割自身的DNA?提示:原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰等。(2)图甲表示EcoRⅠ限制酶及DNA连接酶的作用示意图,图乙表示SmaⅠ限制酶的作用示意图。请据图回答问题:①请写出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列以及切割位点。提示:EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC,切割位点在G和A之间;SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG,切割位点在G和C之间。②限制酶和DNA连接酶的作用部位相同吗?DNA连接酶起作用时,是否需要模板?提示:相同,都是磷酸二酯键。不需要模板。1.基因工程技术使用限制酶需注意的四个问题(1)获取目的基因和切割载体时,经常使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶),目的是产生相同的黏性末端或平末端。(2)获取一个目的基因需限制酶切割两次,共产生4个黏性末端或平末端。(3)限制酶切割位点的选择,必须保证标记基因的完整性,以便于检测。(4)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。2.载体上标记基因的作用载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素,所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞,原理如图所示:-3-考法1考查限制酶、DNA连接酶等酶的作用1.(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。图(a)图(b)根据基因工程的有关知识,回答下列问题:(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接,理由是_________________________________________________________________________________________。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________,不能表达的原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________________。图(c)(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有______________和-4-______________,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。解析:(1)由题图可知,BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是—GATC——CTAG—下列操作与实验目的不符..的是()A.用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上C[A对:C基因两端有EcoRⅠ酶切位点,可用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和(DNA)连接酶构建重组质粒。B对:一般用农杆菌等作为媒介去侵染植物的愈伤组织等,将含有目的基因的质粒导入细胞。C错:据图可知,质粒中含有潮霉素抗性基因,不含卡那霉素抗性基因,故无法用卡那霉素来筛选被转化的菊花细胞。D对:检测C基因是否整合到菊花染色体上,常采用DNA分子杂交技术,即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作为标记,以此作为探针,使探针与C基因杂交,若显示出杂交带,则表明目的基因已插入染色体DNA中。]2.(2015·重庆高考)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述,正确的是()A.表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得B.表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点C.借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来D.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用答案:C3.(多选)(2014·江苏高考)下列关于基因工程技术的叙述,错误..的是()A.切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列B.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应C.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D.抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达答案:ABC4.(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端,获得了L1GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端-5-各不相同。回答下列问题:(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________,也是为了保证________________。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。(3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的______________中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定,在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。解析:(1)据图示信息分析:将L1GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切,既能保证L1GFP融合基因的完整,又能保证L1GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中,经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,采用PCR技术鉴定时,应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。答案:(1)E1和E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核去核卵母细胞(4)核DNA5.(2017·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中没有,原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题:(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原因是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用________作为载体,其原因是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________。-6-(3)若要高效地获得蛋白A,可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比,大肠杆菌具有__________________(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献,也可以说是基因工程的先导,如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示,那么,这一启示是__________________________________________________________________________________。解析:(1)人是真核生物,从人的基因组文库中获得的基因A有内含子,而受体细胞大肠杆菌是原核生物,原核生物基因中没有内含子,相应的就没有切除内含子对应的RNA序列的机制,故无法表达出蛋白A。(2)噬菌体是专一性侵染细菌的病毒,以细菌为宿主细胞,而昆虫病毒侵染的是昆虫,以昆虫为宿主细胞。家蚕属于昆虫,故应选用昆虫病毒作为载体。(3)与家蚕相比,大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点,故要高效地获得蛋白A,可选用大肠杆菌作为受体。(4)检测基因A是否翻译出蛋白A,可用抗原—抗体杂交法。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中,S型细菌的DNA可以使R型细菌发生转化,说明可调控多糖荚膜产生的基因整合到了R型细菌的DNA分子中并成功得以表达。也就是说DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达,这就为基因工程理论的建立提供了启示。答案:(1)基因A有内含子,在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除,无法表达出蛋白A(2)噬菌体噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕(3)繁殖快、容易培养(4)蛋白A的抗体(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体-7-