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-1-EvaluationWarning:ThedocumentwascreatedwithSpire.Docfor.NET.第1讲无菌操作技术[考纲展示]1.微生物的分离和培养2.某种微生物数量的测定3.培养基对微生物的选择作用考点一|微生物的分离和培养1．相关技能、技术和方法(1)无菌操作的技能——灭菌①分类：实验室常用高温处理达到灭菌效果，包括干热灭菌和湿热灭菌。②作用：微生物分离和培养的基础。③关键：防止外来杂菌的入侵。(2)配制培养基①培养基概念：为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养物质。②分类：按化学性质的不同分为天然培养基和合成培养基。(3)接种微生物①接种：指在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。②接种方法和常用工具(连线)接种方法常用工具Ⅰ.涂布平板接种a．接种针Ⅱ.穿刺接种b．接种环Ⅲ.斜面接种c．玻璃涂布器Ⅳ.平板划线接种答案：Ⅰ－cⅡ－aⅢ－bⅣ－b2．大肠杆菌的接种与分离培养(1)配制牛肉膏蛋白胨培养基其操作步骤：配制培养基→调节pH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面。(2)斜面接种和培养大肠杆菌①主要目的：菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。②主要步骤：准备接种→接种环灭菌→试管口灭菌→挑取少许菌种→划线接种→在37_℃恒温箱中培养大肠杆菌24h→将增殖的菌种放置在冰箱的冷藏室中(4℃)保存。(3)平板划线分离和培养大肠杆菌-2-①平板的作用：培养、分离细菌等微生物。②平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。[思考回答]1．微生物接种的核心是什么？提示：防止杂菌污染，保证培养物的纯度。2．如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。(1)获得图A和图B效果的接种方法分别是什么？提示：图A效果是稀释涂布平板法，图B效果是平板划线法。(2)某同学在用A方法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？为了防止杂菌污染，有同学建议加入抗生素，你觉得可以吗？并说明理由。提示：菌液浓度过高(土壤溶液稀释不够)。不可以，因为抗生素不但杀灭杂菌，而且也可以杀灭大肠杆菌，因此在培养基上不可以加入抗生素。1．选择无菌技术的原则(1)考虑无菌技术的效果：灭菌的效果比消毒要好。(2)考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能灭菌。2．微生物的培养基(1)培养基的成分营养要素来源功能碳源无机碳源CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物a.构成细胞物质和一些代谢产物b.既是碳源又是能源(有机碳源)有机碳源糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等氮源无机氮源无机氮：NH3、铵盐、硝酸盐、N2等合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物有机氮源牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸生长因子维生素、氨基酸、碱基a.酶和核酸的组成成分-3-b.参与代谢过程中的酶促反应水培养基、大气、代谢产物不仅是良好的溶剂，还是结构物质无机盐培养基、大气细胞内的组成成分，生理调节物质；某些化能自养型细菌的能源；酶的激活剂(2)根据理化性质对培养基的分类种类特点应用物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产固体培养基加凝固剂微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏化学成分天然培养基含化学成分不明的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确或用一定化学物质配制分类、鉴定(3)根据功能可分为选择培养基和鉴别培养基类型实例选择培养基培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物鉴别培养基伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌(菌落呈黑色)◎考法1考查无菌技术和培养基成分及分类[解题指导]关于培养基的理解-4-1．(2019·江西赣中南五校第一次联考)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。成分蛋白胨乳糖蔗糖K2HPO4指示剂琼脂含量(g)10.05.05.02.00.212.0将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL(1)从生态系统的成分上看，大肠杆菌属于__________。(2)若根据用途划分，该培养基属于__________(填“选择”或“鉴别”)培养基。若要用上述培养基来筛选出土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分必需怎样更改？________________，并用__________作为指示剂。(3)在微生物培养的过程中，为防止杂菌污染，需要对培养基和培养皿进行__________；操作者的双手需要进行清洗和__________。(4)图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是：______________和______________，这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖所形成的__________。图1图2解析：(1)大肠杆菌只能从环境中摄取有机物，不能自己合成有机物，属于分解者。(2)该培养基中含有指示剂，属于鉴别培养基。尿素分解菌可以分解尿素，而其他微生物不能，因此可将培养基中的蛋白胨改为尿素用于筛选土壤中的尿素分解菌，并用酚红作为指示剂，尿素分解菌分解尿素产生了NH3可使酚红变红。(3)培养微生物时，培养基和培养皿需要灭菌，操作者双手需要进行消毒。(4)图1采用的是稀释涂布平板法，图2采用的是平板划线法。单个微生物细胞繁殖所形成的细胞群叫菌落。答案：(1)分解者(2)鉴别将蛋白胨改成尿素酚红(3)灭菌消毒(4)稀释涂布平板法平板划线法菌落2．某研究小组研究了不同浓度的抗生素A对大肠杆菌生长的影响，实验结果见如图1。回答下列相关问题：-5-(1)该培养基为大肠杆菌提供的主要营养物质有碳源、水、无机盐、________四类，而配置该培养基时，通常加入________作为凝固剂。(2)为了确保利用________________法接种大肠杆菌时，形成一层菌膜，则对菌种的稀释倍数________。另外，在培养和接种大肠杆菌时要特别注意进行__________操作。根据实验结果，选出对大肠杆菌抑制作用最明显的抗生素A浓度的依据是_________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)为减少实验误差，每一浓度的抗生素A还要制备________。(4)该研究小组运用上述实验方法还研究了相同浓度的a、b、c三种不同抗生素对大肠杆菌生长的影响。请在图2中图示这一处理方案(可模仿图1加以必要的注解)。解析：(1)微生物生长繁殖所需要的四类主要营养物质是水、无机盐、碳源和氮源。该实验所用的培养基为固体培养基，常用的凝固剂是琼脂。(2)图中接种大肠杆菌时所使用的接种方法是稀释涂布平板法，为了得到菌膜，稀释倍数不能太大。接种和培养大肠杆菌的关键是无菌操作。据图1分析，⑤号圆纸片的抑菌圈最大，说明该浓度的抗生素A对大肠杆菌抑制作用最明显。(3)为减少实验误差，每一浓度的抗生素A还要制备多个圆纸片进行重复实验。(4)该方案的自变量为相同浓度的a、b、c三种不同抗生素，还应有空白对照，注意在图中要标记清楚，具体图解见答案。答案：(1)氮源琼脂(2)稀释涂布平板不能太大无菌透明圈越大，抑制效果越明显(3)多个圆纸片(4)图示见如图所示◎考法2考查微生物的分离和培养3．(2014·全国卷Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是-6-____________________________________；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为________。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过________灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_______________________________________________________________。(3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取灭菌后的空白平板先行培养一段时间。0.1mL稀释液中平均有(39＋38＋37)/3＝38个活菌，则每毫升稀释液中活菌的数目为38/0.1＝380，则稀释前每毫升水样中活菌数目为380×100＝3.8×104，则每升水样中活菌数目为3.8×104×1000＝3.8×107。(2)接种环、接种针等金属用具可直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，以达到迅速彻底灭菌的目的。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)比较图A和图B可以看出：A培养基中细菌的分布呈线性，是用平板划线法接种培养后得到的结果；B培养基中细菌均匀分布，是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格3.8×107(2)灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落(3)B(4)溶解氧营养物质考点二|微生物的分离和计数1．分离特定微生物的知识准备(1)区分涂布平板法和混合平板法-7-①区分两种平板法过程图②结果不同a．涂布平板法：细菌菌落通常仅在平板表面生长。b．混合平板法：细菌菌落出现在平面表面及内部。③目的相同：分离各种目的微生物。(2)选择培养分离①原理：不同微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。②方法：针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。③用途：从众多微生物中分离出特定的微生物。(3)菌落①概念：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。②特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。2．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)培养基采用唯一氮源为尿素的培养基。(2)统计菌落数目统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。(3)实验流程土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。3．纤维素分解菌的筛选(1)原理纤维素分解菌↓-8-刚果红纤维素―→红色复合物――――→纤维素酶红色消失，出现透明圈。(2)筛选方法：刚果红染色法。(3)培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(4)实验流程土壤取样：富含纤维素的环境↓选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度↓梯度稀释：制备系列稀释液↓涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上↓挑选产生：产生透明圈的菌落4．显微镜直接计数法(1)原理：利用血球计数板，