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专题３０克隆技术真题多维细目表真题涉分考点植物的克隆动物的克隆题型难度设题情境试题结构素养要素２０１９浙江４月选考ꎬ３２(二)７植物细胞工程动物的克隆非选择难培育抗病品种并列探究生命观念ꎻ科学探究２０１７浙江１１月选考ꎬ３２(二)７植物的克隆动物的克隆非选择难植物克隆与动物克隆综合并列探究生命观念ꎻ科学探究２０１６浙江１０月选考ꎬ３２(二)７原生质体的分离和培养非选择中烟草原生质体的分离和培养逐级探究生命观念ꎻ科学探究２０１５浙江自选ꎬ１８１０植物的克隆非选择中植物克隆和生态工程综合并列探究生命观念ꎻ科学探究五年均分６.２考频常见考法命题规律与趋势０１考查内容本专题主要考查动、植物克隆的基本原理、方法及其应用ꎮ０２考频赋分本专题为高频考点ꎬ选考分值为７分ꎮ０３题型难度题型以非选择题形式出现ꎬ试题难度多为中等偏难ꎮ０４命题特点设题情境多结合生产生活实际ꎬ考查考生的科学探究、知识迁移等能力ꎮ０５核心素养多考查生命观念和科学探究ꎮ０６命题趋势预计２０２０年高考中ꎬ植物克隆的基本原理和方法仍是考查的重点ꎬ科学思维的比重可能会增加ꎮ典例分析解读专题３０ 克隆技术１４５ 对应学生用书起始页码Ｐ２９１考点１植物的克隆 一、植物的克隆植物的克隆原理:植物细胞的全能性即植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性ꎬ因而都具有发育成完整植株的潜能植物组织培养程序配制培养基 ↓切取消毒的组织块 ↓培养获得愈伤组织 ↓诱导 新植株ìîíïïïïïïïï原生质体培养:植物细胞纤维素酶、果胶酶→原生质体培养→新植株植物细胞工程:外源遗传物质导入→受体细胞培养→具有特定性状的新植株ìîíïïïïïïïïïïïïïïïïïï 二、植物细胞的全能性１.基本含义:植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性ꎬ因而都具有发育成完整植株的潜能ꎮ２.基础:植物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全部遗传物质ꎮ３.全能性表达的条件(１)离体、无菌ꎮ(２)一定的营养物质ꎬ如水、无机盐、蔗糖、维生素等ꎮ(３)植物生长调节剂ꎮ４.在生物体内细胞并没有表现出全能性的原因基因在特定的时间和空间条件下选择性表达ꎬ细胞分化为不同的组织、器官ꎮ５.植物细胞全能性的大小受精卵生殖细胞体细胞分化程度低的细胞分化程度高的细胞６.培养物的胚胎发生和器官形成能力下降的原因(１)染色体畸变、细胞核变异或非整倍体产生等ꎬ而且其结果是不可逆的ꎻ(２)细胞或组织中激素平衡被打破ꎬ或细胞对外源生长物质的敏感性发生改变ꎻ(３)随着时间推移ꎬ由于其他各种原因产生了缺乏成胚性的细胞系ꎮ 三、植物组织培养和植物细胞工程１.植物组织培养程序２.植物细胞工程的操作过程 ３.植物组织培养关键过程总结名称过程形成体特点光脱分化由外植体脱分化为愈伤组织排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞团避光再分化由愈伤组织分化为幼苗或胚状结构有根、芽或有生根发芽的能力需光营养生长和生殖生长发育成完整的植物体由根、茎、叶、花、果实、种子组成需光 ４.植物组织培养基本操作要求(１)取材:含形成层(分生组织)的部分易于诱导形成愈伤组织ꎮ尽管植物体其他已分化的部分也可以用于组织培养ꎬ但诱导形成愈伤组织比较困难ꎮ(２)消毒:培养基中含有丰富的营养物质ꎬ不仅有利于培养物的生长ꎬ也利于各种杂菌的生长ꎮ一旦污染ꎬ迅速生长的各种杂菌不仅会与培养物争夺营养ꎬ还会产生大量对培养物有害的物质ꎬ导致培养物死亡ꎮ (１)植物激素是影响脱分化、再分化的重要因素ꎮ细胞分裂素与生长素不同浓度的配比在再分化过程中ꎬ分别对诱导根或芽的产生起关键作用ꎮ当细胞分裂素与生长素的浓度比高时ꎬ有利于芽的产生ꎻ浓度比低时ꎬ有利于根的产生ꎮ(２)光照:对于植物组织培养来说ꎬ光照条件非常重要ꎬ包括光照强度、时间和波长ꎮ但在愈伤组织的诱导阶段往往要暗培养ꎬ而在分化再生的过程中一定要有光照ꎮ愈伤组织诱导阶段的暗培养有利于细胞的脱分化产生愈伤组织ꎬ如果在光照条件下容易分化产生维管等组织ꎬ则不利于产生大量的愈伤组织ꎮ(３)无菌:如果在培养基上有细菌等微生物ꎬ它们相比植物细胞具有更强的新陈代谢能力ꎬ比植物细胞生长繁殖得更快ꎬ而且它们会产生毒素ꎬ使培养基上的植物细胞死亡ꎮ因此ꎬ在培养过程中要求一系列的消毒、灭菌ꎬ并且要求无菌操作ꎮ(４)非离体状态下ꎬ植物体细胞不能表达全能性的原因:植物体细胞内的基因选择性表达ꎮ ５.植物细胞培养、器官培养和原生质体培养的关系 植物细胞培养、器官培养和原生质体培养统称为植物的组织培养ꎬ都有脱分化和再分化过程ꎬ最终都能得到完整的植株ꎬ但由于培养的目的不同ꎬ有时需要对愈伤组织进行特殊处理ꎬ以达到目的ꎮ１４６ ５年高考３年模拟Ｂ版(教师用书) ６.植物组织培养技术的实践应用(１)植物繁殖新途径:①微型繁殖:用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术ꎬ也叫快速繁殖技术ꎮ②作物脱毒:利用茎尖、根尖等无毒组织ꎬ进行微型繁殖ꎮ③制造人工种子:利用植物组织培养获得胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等ꎬ然后包上人工种皮就形成了人工种子ꎬ如图:(２)作物新品种的培育:①单倍体育种ꎻ②突变体的利用ꎮ举例如下:突变体Ａａ中Ａ为突变基因ꎬ并控制着优良性状ꎬ利用单倍体育种的方法步骤如下:突变体Ａａ减数分裂→配子Ａ、ａ花药离体培养→单倍体Ａ、ａ秋水仙素处理→二倍体ＡＡ、ａａ优点:稳定遗传ꎬ缩短育种年限ꎮ(３)细胞产物的工厂化生产:从人工培养的愈伤组织中提取细胞中的某种成分ꎬ如紫草素等ꎮ考点２动物的克隆 一、动物细胞培养和组织培养１.动物细胞培养从动物体中取出一部分组织ꎬ将其分散成单个的细胞ꎬ然后在人工控制的培养条件下ꎬ使这些细胞得以生存ꎬ并保持生长、分裂(繁殖)乃至接触抑制和有规律的衰老、死亡等生命活动现象ꎮ２.动物组织培养动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性ꎮ动物组织培养过程中可以伴随组织分化ꎮ３.动物细胞培养分析(１)过程组织机械消化或胰酶消化→单个细胞的悬浮液转入培养液→原代培养分瓶→传代培养 ①动物细胞培养中的取材很重要ꎬ大部分取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织ꎬ这是因为这些组织或器官的细胞生命力旺盛ꎬ分裂能力强ꎮ②动物细胞培养中胰蛋白酶可消化组织中的胶原纤维和细胞外的其他成分ꎬ获得单个的细胞悬浮液ꎮ培养前要将组织细胞分散成单个细胞的原因:成块组织不利于培养ꎬ其中的细胞不能与培养液充分接触ꎬ而且动物细胞具有接触抑制的特性ꎬ分散成单个细胞有利于培养ꎮ③原代培养的细胞因代谢消耗和接触抑制现象ꎬ培养到一定时期必须进行传代培养ꎮ(２)原理:细胞增殖ꎮ(３)条件①充足的营养供给———微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等ꎮ②适宜的温度:３６.５℃±０.５℃ꎻ适宜的ｐＨ:７.２~７.４ꎮ③气体环境Ｏ２(９５％的空气):用于需氧呼吸、细胞代谢ＣＯ２(５％):维持ｐＨ{④无菌、无毒环境培养液和培养用具无菌处理培养过程加抗生素杀菌定期更换培养液ꎬ清除代谢产物{(４)应用①生产病毒疫苗、单克隆抗体、干扰素等ꎮ②利用动物细胞培养技术中的细胞贴壁生长和接触抑制的特点ꎬ可用烧伤病人自己的健康皮肤细胞培养出大量的自身薄层皮肤细胞ꎬ以供植皮所需ꎮ③培养的动物细胞用于检测有毒物质ꎬ判断某种物质的毒性ꎮ④用于生理、病理、药理等方面的研究ꎮ 二、原代培养和传代培养 １.原代培养:从机体取出后立即进行的细胞、组织培养ꎮ２.传代培养:将原代培养的细胞分成若干份ꎬ接种到若干份培养基中ꎬ使其继续生长、增殖ꎮ３.原代培养和传代培养比较表述方法原代培养①细胞悬浮液第一次在瓶中培养ꎬ没有分瓶培养之前的细胞培养②第１代细胞的培养与传１０代以内的细胞培养统称为原代培养传代培养①细胞悬浮液培养一段时间后ꎬ分瓶再进行的细胞培养②传１０代以后的细胞培养ꎬ统称为传代培养 三、细胞系和细胞株 １.细胞系:原代培养物在首次传代时就成为细胞系ꎮ２.细胞株:从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞ꎬ一般具有恒定的染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等ꎮ３.细胞系和细胞株比较种类来源特点细胞系有限细胞系由二倍体细胞传代培养建成有接触抑制ꎻ不能连续培养连续细胞系由传代细胞连续培养建成发生了转化ꎬ多数具有异倍体核型ꎻ有些具有异体致瘤性ꎻ有些具有不死性ꎬ但不致癌细胞株有限细胞株连续细胞株通过一定的选择或纯化方法ꎬ从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞传代次数有限可连续多次传代一般具有恒定的染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等 四、克隆培养法 １.概念:把一个单细胞从群体中分离出来单独培养ꎬ使之繁衍成一个新的细胞群体的技术ꎮ２.基本要求:必须肯定所建成的克隆来源于单个细胞ꎮ３.提高细胞克隆形成率的措施选择适宜的培养基添加血清以滋养细胞支持生长激素刺激使用ＣＯ２培养箱调节ｐＨ等ìîíïïïïïïï４.培养结果:细胞克隆的遗传性状均一ꎬ表现的性状相似ꎬ便于研究ꎮ专题３０ 克隆技术１４７ ５.应用①分离出缺乏特殊基因的突变细胞系ꎮ②研究遗传规律和生理特性的重要材料ꎮ 五、动物细胞融合技术及应用１.原理:细胞膜的流动性ꎮ２.方法:物理法(电激)、化学法和生物法(灭活病毒)ꎮ３.应用:制备单克隆抗体ꎬ过程如下:给小鼠注射特定的抗原→从脾脏中分离Ｂ淋巴细胞(浆细胞)培养骨髓瘤细胞→骨髓瘤细胞üþýïïïï灭活病毒诱导融合→未融合细胞同种融合细胞杂交瘤细胞{}选择培养→杂交瘤细胞 多次克隆、检验↓ 单克隆抗体←体内培养体外培养{}特定杂交瘤细胞群４.单克隆抗体的特点:特异性强ꎬ灵敏度高ꎬ并可大量制备ꎮ 六、单克隆抗体的制备１.原理:一个(或一种)浆细胞(效应Ｂ细胞、Ｂ淋巴细胞)只产生一种抗体ꎬ小鼠骨髓瘤细胞能够无限增殖ꎮ因此杂交瘤细胞就具备了既能无限增殖ꎬ又能大量产生单一抗体的特征ꎮ２.过程:３.培养方法:体内培养和体外培养ꎮ４.单克隆抗体的主要优点:特异性强ꎬ灵敏度高ꎬ可大量制备ꎮ５.关键点分析:①细胞融合完成的标志:细胞核融合成一个核ꎮ②杂交瘤细胞特性:既能无限增殖ꎬ又能产生大量特异抗体ꎮ③获取单克隆抗体的场所:若在培养基中进行杂交瘤细胞培养ꎬ则从培养液中提取ꎻ若在小鼠或其他动物腹腔中培养ꎬ则从腹水中提取ꎮ④两次筛选的比较:项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后得到多种杂交细胞ꎬ另外还有未融合的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激ꎬ所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选:未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“ＢＢ”细胞、“瘤瘤”细胞)都会死亡ꎬ只有融合的杂交瘤细胞(“Ｂ瘤”细胞)才能生长用多孔培养皿培养ꎬ在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测ꎬ经多次筛选得到能产生特异抗体的细胞群筛选目的得到杂交瘤细胞得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 七、动物的克隆繁殖１.动物细胞全能性的表现程度受精卵具有全能性多能细胞只具有分化出多种组织细胞的潜能单能细胞只能分化为一种细胞已经分化的细胞不再分化为其他细胞ìîíïïïï２.动物难以克隆的根本原因是动物的个体发育过程中ꎬ细胞分化使得细胞发生了基因的差异表达ꎬ细胞基因组中基因的活动很不完全ꎮ３.细胞核移植实验和动物的克隆繁殖(１)核移植:利用一个细胞的细胞核来取代另一个细胞中的细胞核ꎬ形成一个重建的“合子”ꎮ(２)动物的克隆繁殖卵母细胞细胞质→重组细胞→→体细胞→细胞核早期胚胎→另一雌性个体代孕→克隆动物 ①动物难以克隆的根本原因:分化了的动物细胞的细胞质中的调