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第九单元生物技术实践专题２５ 微生物的利用真题多维细目表真题涉分考点微生物的培养和利用题型难度设题情境试题结构素养要素２０１８浙江１１月选考ꎬ３２(一)７微生物的培养和应用非选择难微生物的综合应用并列探究生命观念ꎻ科学探究２０１６浙江１０月选考ꎬ３２(一)７分离以尿素为氮源的微生物及酶的固定化非选择中从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶的固定化逐级探究生命观念ꎻ科学探究２０１５浙江自选ꎬ１７１０特定菌株的筛选、酶的固定化非选择中筛选产耐高温植酸酶菌株及酶的固定化逐级探究生命观念ꎻ科学探究五年均分４.８考频常见考法命题规律与趋势０１考查内容本专题主要考查微生物培养和分离的一般方法ꎮ０２考频赋分本专题为高频考点ꎬ选考分值约７分ꎮ０３题型难度题型以非选择题形式出现ꎬ试题整体难度多为中等ꎮ０４命题特点设题情境多结合生产生活实际ꎬ考查考生的科学探究、知识迁移等能力ꎮ０５核心素养多考查生命观念和科学探究ꎮ０６命题趋势预计２０２０年高考中微生物的培养和分离技术在生产中的应用仍是考查的重点ꎬ科学思维的比重可能会增加ꎮ典例分析解读１２４ ５年高考３年模拟Ｂ版(教师用书)对应学生用书起始页码Ｐ２５２考点微生物的培养和利用 一、微生物的实验室培养１.培养基(１)概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求ꎬ配制出供其生长繁殖的营养基质ꎮ(２)成分:一般都含有碳源、氮源、水和无机盐ꎬ还需要满足不同微生物生长对ｐＨ、特殊营养物质以及氧气的要求ꎮ ２.无菌技术方法消毒煮沸消毒法化学药剂消毒法紫外线消毒法{灭菌灼烧灭菌干热灭菌高压蒸汽灭菌{ìîíïïïï ３.实验操作牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备:计算→称量→溶化→灭菌→倒平板ꎮ 二、细菌的分离方法:划线分离法和涂布分离法１.划线分离法(１)方法:用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的平板上划线ꎬ使聚集的菌种分散到培养基的表面ꎮ每个菌落就是一个细菌产生的后代ꎮ(２)应用:用于基因工程的大肠杆菌等工程菌ꎬ可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株ꎮ工程菌的质粒中通常有抗性基因(如抗氨苄青霉素基因)ꎬ如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素ꎬ由于非工程菌和其他杂菌都没有抗性基因ꎬ所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来ꎮ２.涂布分离法:先将培养的菌液稀释ꎬ通常稀释１０５~１０７倍ꎬ然后取０.１ｍＬ稀释度不同的菌液ꎬ加在培养皿的固体培养基上ꎬ用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养ꎬ在适当的稀释度下ꎬ可产生相互分开的菌落ꎮ３.二者比较:划线分离法ꎬ方法简单ꎻ涂布分离法ꎬ单菌落更易分开ꎬ但操作复杂ꎮ 三、无菌技术的知识归纳１.灭菌原因:为了获得纯净的培养物ꎬ关键是防止外来杂菌的污染ꎮ２.无菌操作的条件:(１)各种器皿必须是无菌的ꎻ(２)各种培养基必须是无菌的ꎻ(３)细菌转移操作的过程必须是无菌的ꎮ３.三种常用灭菌方法的比较灭菌方法适用材料或用具灭菌条件灭菌时间灼烧灭菌接种环、接种针或其他金属用具在酒精灯火焰的燃烧层充分灼烧直至烧红干热灭菌玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等干热灭菌箱内ꎬ１６０℃~１７０℃加热１ｈ~２ｈ高压蒸汽灭菌培养基等１２１℃(１ｋｇ/ｃｍ２压力)１５ｍｉｎ~３０ｍｉｎ ４.避免被杂菌污染的方法(１)注意灭菌操作原则ꎬ灭菌彻底ꎬ降低环境污染概率ꎬ手和实验服要清洁ꎬ减少操作时间ꎬ对污染源的改善考虑周到ꎮ(２)注意微生物生长条件ꎬ如ｐＨ、渗透压、温度等ꎮ细菌喜中性偏碱的环境ꎬ喜蛋白质丰富的营养物质ꎬ喜３７℃的温度ꎻ而霉菌喜中性偏酸的环境ꎬ喜糖类丰富的营养物质ꎬ喜２５℃~３０℃的温度ꎮ因此ꎬ可以根据不同微生物的“喜好”来减少污染ꎮ 四、大肠杆菌的培养和分离１.大肠杆菌:革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌ꎮ２.细菌的繁殖:以分裂的方式繁殖ꎬ分裂速度很快ꎮ３.细菌的扩大培养:用ＬＢ液体培养基ꎬ划线分离用ＬＢ固体培养基ꎮ４.大肠杆菌的分离操作技术最常用的方法是划线分离法ꎬ其操作步骤如下:ａ.培养基灭菌:将刚配制好的５０ｍＬＬＢ液体培养基和５０ｍＬＬＢ固体培养基分别装入两个２５０ｍＬ的三角瓶中ꎬ加上封口膜ꎬ用高压蒸汽灭菌法进行灭菌ꎮｂ.倒平板:在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在４个培养皿中ꎬ使培养基铺满培养皿底部ꎬ待凝固后即形成平面ꎮｃ.接种扩大培养:靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角瓶的液体培养基中ꎬ三角瓶在３７℃ꎬ每分钟２００转的摇床上振荡培养１２ｈꎮｄ.划线分离:将摇床上培养１２ｈ的菌液在固体培养基的平板上连续划线ꎬ然后将盖好的培养皿倒置ꎬ放在３７℃恒温培养箱中进行培养ꎬ１２~２４ｈ后ꎬ可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落ꎬ表明菌已被分离ꎮｅ.菌种保存:在无菌操作下将单菌落用接种环取出ꎬ再用划线法接种在空白斜面上ꎬ在３７℃下培养２４ｈ后ꎬ置于４℃冰箱中保存ꎮ 五、大肠杆菌的培养与分离中应注意的问题１.划线分离操作中的有关问题(１)在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环ꎬ在划线操作结束后ꎬ仍然需要灼烧接种环ꎮ第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种杀死接种环上残留的菌种ꎬ避免细菌污染环境或感染操作者 (２)在灼烧接种环之后ꎬ要等其冷却后再进行划线ꎬ以免接种环温度太高ꎬ杀死菌种ꎮ(３)在进行第二次以及其后的划线操作时ꎬ要从上一次划线的末端开始划线ꎮ每次划线后ꎬ线条末端细菌的数目比线条起始处要少ꎬ每次从上一次划线的末端开始划线ꎬ能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少ꎬ最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落ꎮ２.进行恒温培养时ꎬ要将培养皿倒置的原因如果正放培养皿ꎬ则皿盖上形成的水滴会落到培养基表面并且扩散开ꎬ会冲散菌体ꎬ污染菌落ꎬ达不到分离的目的ꎮ因此恒温培养时ꎬ培养皿必须倒置ꎮ３.培养后判断是否有杂菌污染的方法(１)从菌落的形态看ꎬ湿润度、透明度、黏稠度ꎬ呈何种颜色等ꎬ是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标ꎮ(２)用显微镜镜检ꎬ观察菌的形态、大小ꎬ菌丝、孢子、芽孢等也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标ꎮ专题２５ 微生物的利用１２５ (３)上述方法较难区分同类的不同物种ꎬ需要借助化学方法和进一步的形态观察ꎬ如用革兰氏染色法ꎬ观察有无鞭毛、孢子形态、孢子着生方式、菌丝生长方式、芽孢等ꎮ 六、分离以尿素为氮源的微生物１.实验原理:不同微生物利用氮源种类不同ꎮ有一些细菌含有脲酶ꎬ通过降解尿素作为其生长的氮源ꎮ尿素在脲酶的降解下产生ＮＨ３ꎬ使培养基的ｐＨ由原来的中性变为碱性ꎬ于是培养基中的酚红由红黄色变成红色ꎮ２.实验步骤:(１)制备培养基:在６０℃左右时ꎬ将两个三角瓶中已灭菌的ＬＢ固体培养基和尿素固体培养基ꎬ在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中ꎬ摇匀后平放至凝固ꎮ(２)制备细菌悬液:在无菌条件下ꎬ将１ｇ土样加到有９９ｍＬ无菌水的三角瓶中ꎬ振荡１０ｍｉｎꎬ即成１０－２土壤稀释液ꎬ依此方法制备１０－３、１０－４和１０－５的土壤稀释液ꎮ(３)涂布法分离:取１０－４和１０－５的土壤稀释液各０.１ｍＬꎬ分别加到有ＬＢ培养基和尿素培养基的培养皿中ꎬ用通过灼烧法灭菌的玻璃刮刀将菌液涂布到整个平面上ꎮ(４)培养和观察:在３７℃恒温箱中培养２４~４８ｈꎬ观察菌落数ꎮ３.预测本实验的结果:ＬＢ全营养固体培养基上的菌落多而杂ꎻ尿素固体培养基上的菌落少而纯ꎬ一定时间内ꎬ菌落周围出现红色区域ꎮ用浓度为１０－４和１０－５的土壤稀释液接种ꎬ更容易形成单菌落的是１０－５土壤稀释液ꎮ 七、分离以尿素为氮源的微生物实验剖析１.土样的获得:从有哺乳动物排泄物的地方取得ꎮ２.实验步骤: ３.两种常用微生物接种方法比较比较划线分离法涂布分离法原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作ꎬ将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面ꎮ在数次划线后培养ꎬ可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体ꎬ即菌落将菌液进行一系列的梯度稀释ꎬ然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面ꎬ进行培养ꎮ在稀释度足够高的菌液里ꎬ聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞ꎬ从而能在培养基表面形成单个的菌落特点方法简单单菌落更易分开ꎬ但操作复杂些目的使培养基上形成由单个细胞繁殖而来的子细胞群体———菌落 (１)培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红)ꎬ标志着存在脲酶水解尿素的作用ꎬ从而证明这一菌株可以尿素为氮源ꎮ红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少ꎮ红色区域越大ꎬ表明菌株利用尿素的能力越强ꎮ(２)与全营养培养基上的菌落数比较ꎬ尿素培养基上只有少数菌落ꎬ这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极小部分ꎮ 分离以尿素为氮源的微生物实验中为何用琼脂糖替代琼脂?提示:用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基是因为琼脂是未被纯化的混合物ꎬ内含一定量的含氮化合物ꎬ不利于以尿素为氮源的细菌的筛选ꎮ对应学生用书起始页码Ｐ２５４消毒与灭菌(科学思维)消毒灭菌条件使用较为温和的理化方法使用强烈的理化因素结果杀死物体表面或内部一部分微生物杀死物体内外所有的微生物适用实验操作的空间、操作者的衣着和手微生物的培养器皿、接种用具和培养基等常用方法煮沸消毒法ꎬ巴氏消毒法ꎬ酒精、氯气、石炭酸等化学药剂消毒法灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理ꎬ这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )Ａ.接种环、手、培养基Ｂ.高压锅、手、接种环Ｃ.培养基、手、接种环Ｄ.接种环、手、高压锅解析 一般来说灭菌是指彻底杀死微生物使其永远丧失生长繁殖的能力ꎬ对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌ꎮ消毒仅指杀死物体表面或内部一部分微生物ꎬ而对被消毒的物体基本无害ꎬ操作者的手需要消毒ꎮ高压蒸汽灭菌锅是灭菌设备ꎬ通常用于培养基的灭菌ꎮ用酒精擦拭双手是消毒的一种方法ꎮ火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌ꎬ适用于微生物的接种工具ꎬ如接种环ꎮ１２６ ５年高考３年模拟Ｂ版(教师用书)答案 Ｃ【思维点拨】 (１)高温加热灭菌ꎬ其原理就是使细菌体内的蛋白质变性ꎬ从而达到杀灭细菌的作用ꎮ(２)化学药剂消毒法ꎬ其作用原理是使细菌体内蛋白质变性ꎬ但是化学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外层进入细胞内ꎬ因此此方法难以消灭孢子和芽孢ꎮ(３)体积分数为７０％的乙醇杀菌效果最强ꎮ浓度过低ꎬ杀菌力弱ꎻ浓度过高ꎬ使菌体表面蛋白质凝固形成一层保护膜ꎬ乙醇分子不能渗入细菌内ꎬ杀菌效果受影响ꎮ对刚洗刷后未干的器皿ꎬ则可选择７５％的酒精进行消毒ꎮ(４)灭菌的目的:无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外ꎬ还能有效避免操作者自身被微生物感染ꎮ(５)培养基的制作是否合格的验证:如果未接种的培养基在恒温箱中保温１~２天后无菌落生长ꎬ就说明培养基的制备是成功的ꎬ否则需要重新制备ꎮ１－１ 无菌操作技术是微生物培养过程的关键ꎬ试回答以下问题ꎮ(１)下列材料或用具中:①培养细菌用的培养基与培养皿 ②玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管 ③实验操作者的双手需要灭菌的是: ꎻ需要消毒的是: ꎮ(填序号)(２)实验结束后ꎬ使用过的培养基应该进行 处理后ꎬ才能倒掉ꎮ１－１答案 (１)①和② ③ (２)灭菌解析 灭菌与消毒是两个不同的概念ꎬ一般说来灭菌是指彻底杀死微生物使其永远丧失生长繁殖的能力ꎬ对于培养基、培养器皿和接种环等都需要灭菌ꎮ消毒仅指杀死物体表面或内部的部分微生物而对被消毒的物体基本无害ꎬ操作者的双手需要消毒ꎮ