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1第1讲基因工程考纲要求核心素养1.基因工程的诞生Ⅰ2．基因工程的原理及技术(含PCR技术)Ⅱ3．基因工程的应用Ⅱ4．蛋白质工程Ⅰ生命观念结合生活或生产实例，利用基因的结构与功能理解基因工程的原理及蛋白质工程的概念及流程。科学探究针对人类生产或生活的需求，选取恰当的基因工程技术和方法，尝试提出初步的工程学构想，进行简单的设计和制作。社会责任面对日常生活或社会热点话题中与基因工程有关的话题，基于证据运用生物学基本概念和原理，就基因工程与安全性表明自己观点并展开讨论。基因工程的工具授课提示：对应学生用书第198页[基础突破——抓基础，自主学习]1．限制性核酸内切酶(1)存在：原核生物中。(2)作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)形成末端类型识别序列中心轴线两侧切开→黏性末端识别序列中心轴线处切开→平末端2．DNA连接酶(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只“缝合”黏性末端黏性末端和平末端都可“缝合”3.载体(1)条件：能在受体细胞中自我复制；具有一个至多个限制酶切割位点；具有特殊的标记基2因。(2)种类最常用：质粒其他：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒(3)作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。[重难突破——攻重难，名师点拨]1．限制酶和DNA连接酶的关系(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。2．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较名称作用底物作用部位形成产物限制酶DNA分子磷酸二酯键带黏性末端或平末端的DNA片段DNA连接酶DNA片段磷酸二酯键重组DNA分子DNA聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键子代DNA分子热稳定DNA聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键子代DNA分子DNA(水解)酶DNA分子磷酸二酯键游离的脱氧核苷酸解旋酶DNA分子碱基对间的氢键脱氧核苷酸长链RNA聚合酶核糖核苷酸磷酸二酯键单链RNA分子3.载体的作用及作为载体的条件(1)作用：①作为运载工具，将目的基因转移到受体细胞内。②利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。(2)条件与目的3条件目的对受体细胞无害不影响受体细胞正常的生命活动在受体细胞中稳定存在并大量复制目的基因数量可扩增有一个至多个限制酶切割位点以便与外源基因连接具有特殊的标记基因以便将含有目的基因的受体细胞筛选出来4.基因工程中基本工具的8个易错点(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。[题型突破——练题型，夯基提能]1．质粒是基因工程中最常用的运载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图表示外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌的生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是()A．①是c；②是b；③是a4B．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是b解析：第①组中重组后细菌能在含氨苄青霉素和含四环素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏，因此外源基因插入位置是c。第②组中重组后细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素的培养基上生长，说明四环素基因被破坏，因此外源基因插入位置是b。第③组重组后细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因被破坏；细菌能在含四环素的培养基上生长，说明抗四环素基因没有被破坏，因此外源基因插入位置是a。答案：A2．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：—GAATTC——CTTAAG—为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是____________________________________________________________________________________。(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。(4)基因工程中除质粒外，________________和________________也可作为运载体。解析：(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种——黏性末端和平末端。(2)为了保证目的基因与运载体相连，用另一种限制酶切割含目的基因的DNA后形成的黏性末端必须与EcoRⅠ切割形成的黏性末端相同。(3)DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类。(4)在基因工程中使用的运载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。答案：(1)黏性末端平末端(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同(3)E·coliT4(4)λ噬菌体的衍生物动植物病毒3．(2018·山西晋中模拟)为增加菊花的花色类型，研究者从其他植物的cDNA文库中提取出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花细胞中。图3从上到下依次表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。请分析回答：5(1)利用PCR技术扩增目的基因C的原理是____________________________。(2)图2所示质粒被________________切割获得的产物可与图1所示基因C连接，理由是__________________________________________________。(3)经BamHⅠ处理后构建的重组质粒导入菊花细胞后，基因C不能表达，原因是质粒酶切部位的两端无________________________，导致基因C不能__________。(4)在添加四环素的固体培养基上，________(填“能”或“不能”)筛选出含有插入基因C的重组质粒的农杆菌单菌落，原因是___________________________________________________________________________________________。解析：(1)利用PCR技术扩增目的基因C的原理是DNA双链复制。(2)据图3可知，由于BamHⅠ和Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端，因此图2所示质粒被BamHⅠ和Sau3AⅠ切割获得的产物可与图1所示基因C连接。(3)据图可知，经BamHⅠ处理后构建的重组质粒导入菊花细胞后，基因C不能表达，原因是质粒酶切部位的两端无启动子和终止子，导致基因C不能转录。(4)由于含质粒的农杆菌和含重组质粒的农杆菌均含有抗四环素基因，在含四环素的培养基上均能生长，所以在添加四环素的固体培养基上，不能筛选出含有插入基因C的重组质粒的农杆菌单菌落。答案：(1)DNA双链复制(2)BamHⅠ和Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(3)启动子和终止子转录(4)不能含质粒的农杆菌和含重组质粒的农杆菌均含有抗四环素基因，在含四环素的培养基上均能生长[方法规律]限制酶的选择方法1．应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。2．切割质粒时，一般所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因、启动子和终止子等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选限制酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段6进入受体细胞后不能自主复制。3．为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用两种不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切点)。基因工程的基本操作程序授课提示：对应学生用书第200页[基础突破——抓基础，自主学习]基因工程的基本操作程序[重难突破——攻重难，名师点拨]71．目的基因的获取(1)从基因文库中获取①基因组文库与部分基因文库的构造②从基因文库中获取目的基因的方法可根据基因的核苷酸序列、基因功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA等信息获取。(2)人工合成目的基因的常用方法①化学合成法：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。②反转录法：以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。(3)通过PCR技术扩增目的基因①原理：DNA复制②需要条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。③过程：变性(90～95℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链→复性(55～60℃)：引物与DNA模板结合，形成局部双链→延伸(70～75℃)：在Taq酶作用下从引物起始进行互补链的合成→循环重复上述过程，n次循环后，目的基因的量将被扩增2n倍。2．基因表达载体的构建(1)基因表达载体的组成及作用(2)基因表达载体的构建过程8[特别提醒](1)目的基因的插入位点不是随意的基因表达需要启动子与终止子的调控，目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。(2)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。3．将目的基因导入受体细胞(1)导入植物细胞：农杆菌转化法、花粉管通道法、基因枪法；(2)导入动物细胞：显微注射法(注射到受精卵内)；(3)导入微生物细胞：感受态细胞法(Ca2＋处理法)。[特别提醒]基因工程产物不同、选择的受体细胞类型也不相同(1)培育转基因植物：受体细胞可以是受精卵、体细胞(需经植物组织培养成为完整植株)。(2)培育转基因动物：受体细胞为受精卵，若用体细胞作为受体细胞，则需经核移植技术培养成转基因动物。(3)生产蛋白质产品：一般选用大肠杆菌等原核生物作为受体细胞，因原核生物具有一些其他生物没有的特点，如繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。4．目的基因的检测与鉴定[特别提醒](1)基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。(2)只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象，其余三步都有碱基互补9配对现象。[题型突破——练题型，夯基提能]1．几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是______________________。提取RNA时，提取液中需添加