1课程安排以及植物组织培养简介

本课程公共邮箱账号：[e-mail]密码：pb2015通讯地址：中山大学南校区生命科学大学院曾宪梓堂南院416E-mail:[e-mail]电话：[phone]黄霞植物组织培养与转基因技术应用植物组织培养简介植物组织培养的设施与基本技术培养基植物组织培养在园艺学和林学上的应用原生质体培养与体细胞杂交植物细胞培养与次生代谢物生产课程安排转基因技术的重要性植物的基因转化方法转基因植物的检测转基因作物转基因植物生物反应器上课期间布置2-3次课外作业，作为平时成绩第13周进行期末考笔试（开卷）成绩评定：平时成绩占40%，笔试成绩占60%分子育种体细胞杂交育种诱变育种20世纪80年代以来，生物技术（biotechnology）一词由专业性刊物逐步走向大众。过去：将生物发酵制造酱油等产品的技术称为生物技术，即利用生物通过工业化途径获得产品的技术总称。今天：以活体生物为基础来制造产品或改良品种的技术的总称。其以现代生物学理论为基础，以基因工程为核心。狭义的植物生物技术是指：在离体条件下，对植物（细胞）进行遗传改良或使其增殖的各种技术的总称。包括细胞水平和分子水平两个大的层面。植物生物技术育种植物生物技术生产应用关系图器官培养(Organculture)种苗生产(Seedlingproduction)育种(Breeding)生物产量分离与精制(Bio-massforseparationandpurification)医药品等有用物质生产Productionformedicaments细胞培养(Cellculture)植物离体培养(Invitroculture)细胞固定(Cellfixation)种质保存(Germplasmpreservation)遺传修饰(Geneticmodification)必要技术应用技术植物组织培养植物组织培养（Tissueculture）是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（invitroculture）或试管培养。有性繁殖：经雌、雄配子的结合，形成合子。合子经过胚胎发生发育成胚，胚再经一系列的细胞分裂和分化，最终形成具有完整结构的植物体。无性繁殖：不经过雌、雄配子的结合，而是用其母体的一部分直接产生新个体的繁殖方式。自然界高等植物个体发育过程中，具有两种繁殖方式：植物组织培养的理论基础—“植物细胞全能性”例如：大蒜的分瓣繁殖、唐菖蒲球茎繁殖、百合的鳞片繁殖；马铃薯的茎芽繁殖、草莓扦插繁殖、葡萄的压条繁殖、菊花的芽插繁殖;枣树的断根繁殖、秋海棠的叶片繁殖。无性繁殖无性繁殖方式各有不同：利用原有的芽、茎和根来繁殖既无芽又无根也能繁殖成植株。如：秋海棠叶器官再生；枣树根部伤处形成愈伤组织再分化成株。细胞学说：细胞是一切多细胞生物的基本结构单位，对单细胞生物来说，一个细胞就是一个个体；多细胞生物的每个细胞为一个生命活动单位，执行特定的功能；现存细胞通过分裂产生新细胞。19世纪30年代，德国植物学家施莱登（Schleiden）和德国动物学家施旺（Schwann）创立了细胞学说（celltheory）。施莱登施旺1902年，德国植物生理学家Haberlandt大胆地提出了：高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点。并且预言“植物的体细胞在一定条件下，可以如同受精卵一样，具有潜在发育成植株的能力”。1958年，Steward和Shantz以胡萝卜根韧皮部细胞，经液体培养得到完整的小植株，并开花结实。首次在实验室里，使普通的营养细胞（体细胞）发育成为一个完整的植物体。证明了植物细胞具有发育成植株的潜在能力。这种潜在能力就是“细胞全能性”。1964年，印度德里大学Guba和Maheshwari，在培养毛叶曼陀罗花药时，得到由小孢子发育而来的小植物，1966年经过细胞学鉴定是单倍体。这一结果证明生殖细胞和体细胞一样，在离体条件下也能表现其发育成完整植物体的潜在能力。植物细胞全能性的概念植物每一个具有完整细胞核的细胞，都含有该植物体的全部遗传信息，在适当条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。全能性概念的两个含义：植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息。每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜在能力。为什么植物细胞具有“全能性”，而动物细胞不表现“全能性”或表现能力弱呢?植物是自养的，植物细胞内有叶绿体，可以进行光合作用，制造有机养分，还可以通过强大的根系选择性吸收各种无机营养和水分。动物则不行，它所需要的养分和水分，完全是由外界供给的。植物仅要求简单的无机营养并可通过自身的光合作用制造有机营养。动物除要求无机营养外，还要求供给复杂的大分子有机营养。动物、植物在营养需要上的不同植物养分及水分的吸收和运输，依靠简单的输导组织，如木质部将水分和无机营养运往身体各个部位，由韧皮部将光合产物(有机营养)运往植物体内各个部位。动物摄入各种有机、无机营养和水分后，要通过各种复杂的系统，如消化系统、神经系统、循环系统送往全身。植物通过胞间连丝进行物质交换，通过细胞内的液泡调节渗透压。故植物可以吸收稀薄的养分，进行自身浓缩来满足植物体生长发育的需要。动物则不行，动物是在浓缩的环境中生活，不满足这种条件，动物的生长发育就会受到影响。动物、植物的代谢类型不同植物具有顶端分生组织和次生分生组织。因此，植物器官的建成，可以多次重复，是无限的。动物器官建成是在发育的早期阶段，一次发育形成不能重复。植物胚胎是通过胚柄与母体相连，通过胚柄吸收营养，同时还通过吸收胚乳的营养来发育。动物胚胎是通过胎盘与母体相连，通过血液循环吸收营养。动物、植物发育方式的不同由于动物、植物在营养需要、代谢类型、发育方式和对刺激的反应上的不同。使得动物、植物在器官建成上具有很大差别。因此，离体植物细胞在一定条件下，可以如同受精卵一样，具有潜在发育成完整植物体的能力。离体动物细胞在一定条件下，只能细胞分裂，而很难或不能细胞分化和器官建成。只要具有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使是已经高度成熟和分化的细胞，也还保持着回复到分生状态的能力。只有像核已开始解体的筛管和木质部成分，或细胞壁厚于2微米的纤维细胞（成熟的管胞壁厚达7微米），才不能再进行分裂。按照Gautheret（1966）的看法，一个细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在原来所处的自然部位上已经达到的细胞和生理状态。植物：因此，无性繁殖时，从植株的基部切取枝条扦插，发育出的新株具有幼态的叶型、茎型，及幼态的刺，并易生根。树木发育的层次，即从基部至顶端经历着从幼态状态至成熟状态的梯度•基部是幼龄程度最大•中间为过渡型•顶端则成年程度最大组织分裂分化细胞分裂已分化组织细胞脱分化分裂再分化器官植株植物细胞全能性的表达所谓细胞分化，即由于细胞的分工而导致的细胞结构和功能的改变，或发育方式改变的过程。根结构：表皮细胞排列整齐，没有细胞间隙，形状扁平，细胞壁薄，不具有叶绿体；功能是选择性吸收无机营养和水分。叶结构：表皮细胞外壁，由一层脂肪性物质组成的角质层所覆盖；气孔由一对新月型细胞构成，叶肉细胞位于表皮和皮层之间，排列整齐，细胞内含有叶绿体。功能是进行光合作用，合成有机营养。植物细胞的分化根与叶之不同，显然是由于分工的不同，从而产生细胞结构和功能的不同或发育方式的不同。所以在植物个体发育过程中，细胞分化是个“前导”，细胞分化的结果，必然导致形态发生，从而形成不同器官，不同器官又执行着不同功能。根的结构叶的结构植物细胞的脱分化所谓细胞脱分化（dedifferentiation），即失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生组织状态，或胚性细胞状态。愈伤组织（callus）是指植物在受伤后于其伤口表面形成的一团薄壁细胞。在植物组织培养中，则指在人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞。植物细胞脱分化的条件：植物细胞的机械隔离和生理隔离植物激素的作用整体植物的每个细胞、组织和器官均受其周围的细胞、相邻的组织、器官的制约。一般情况下，它们只能执行着自己特定的功能。这种相互制约的关系，使植物体形成一个协调的整体。整体植物细胞间，由胞间连丝所连结，使植物体成为一个“共质体”，胞间连丝保持植物代谢和发育上的协调一致。植物细胞的机械隔离和生理隔离根据细胞“全能性”观点，植物体的任何一个已分化的细胞，都保持着发育成完整植物体的潜在能力。换句话说，就是保持着分生组织状态的潜势。它之所以不能恢复分裂能力，回复到分生组织状态，是因为它们处于被制约、被抑制的状态。有人设想是否有某种抑制物质在起作用?柑橘实验证明了这一设想，柑橘一般是多胚种，除有性胚外，还有不少由珠心组织形成的不定胚。但也有单胚种，发现造成单胚的原因，是由于单胚种的珠心组织中，存在一种抑制珠心胚形成的物质。把这种物质加入到培养基中，培养多胚种柑橘的珠心愈伤组织，结果抑制了珠心胚的形成。同时，把这种物质用来培养胡萝卜愈伤组织，也抑制了胡萝卜胚状体的形成。这一例子说明，在整体植物中，细胞全能性所以受到遏制，可能与一些抑制物质有关。那么，设法消除某些抑制物质，势必就能恢复植物细胞的分裂、分化能力。植物离体培养时由于切割，也就是把器官、组织或细胞从整体植物上分离下来。实际上是一种人为的机械和生理隔离，这种切割使它们脱离整体，消除了制约，大量事实已经证明，由于切割而造成的机械和生理隔离对植物细胞脱分化、再分化无疑是十分重要的，也可以说是植物细胞“全能性”表现的重要措施。植物细胞的再分化细胞再分化（redifferentiation）即脱分化后的分生细胞在特定的条件（离体培养）下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生（organogenesis）形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生（embryogenesis）形成双极性的胚状体（embryois），进一步发育成完整植物体的过程。组织培养植株再生的途径体细胞胚胎发生途径：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程，形成具有双极性的类似合子胚的胚状结构，而发育成再生植株的途径。●直接体细胞胚胎发生途径●间接体细胞胚胎发生途径器官发生途径：由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法。●直接器官发生途径●间接器官发生途径直接器官发生途径间接器官发生途径直接体细胞胚胎发生途径叶柄外植体诱导愈伤组织愈伤组织继代培养胚性愈伤组织悬浮培养发育成熟的体胚体胚萌发体胚再生小植株移栽土壤的体胚再生植株间接体细胞胚胎发生途径植物组织培养的建立与发展探索阶段奠基阶段迅速发展阶段探索阶段1902年Haberlandt（德国）在“细胞学说”的推动下，提出了高等植物细胞全能性理论。1904年，Hanning将萝卜和辣根菜的未成熟胚分离培养，成功地在含无机盐和糖的培养基上将其培养为成熟胚。1922年，Kotte（德国）和Robins（美国）同时进行根尖培养，虽然可延长根尖生长时间，但其最终仍然死亡。（20世纪初至20世纪30年代中）Haberlandt的贡献：首次进行了离体细胞培养实验在1902年发表的“植物离体细胞培养实验”的报告中，提出了胚囊液在组织培养中的作用和看护培养法等科学的预见。培养基：加入蔗糖的Knop溶液材料：取小野芝麻和凤眼兰的栅栏组织、虎眼万年青属植物的表皮分离单个细胞结果：细胞生长、细胞壁加厚和淀粉形成等，但没有细胞分裂实验失败的原因：所选用的实验材料都是已经高度分化了的细胞所用的培养基过于简单奠基阶段（20世纪30年代中至50年代末）到了20世纪30年代中期，植物组织培养领域出现了两个重要的发现：（1）认识了B族维生素对植物生长的重要意义；（2）发现了生长素是一种天然的生长调节物质。1934年，White（美国）由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并在以后2