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-1-EvaluationWarning:ThedocumentwascreatedwithSpire.Docfor.NET.微生物的实验室培养课题1微生物的实验室培养学习目标：1.知道培养基的种类、营养要素及配制原则。(重点)2.掌握消毒、灭菌的原理和方法。(重点)3.学会配制培养基和纯化大肠杆菌的方法。(重、难点)1．培养基(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)种类：按物理性质分液体培养基：配制成的液体状态的基质（加入凝固剂，如琼脂）固体培养基：配制成的固体状态的基质(3)营养组成：各种培养基一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质(如维生素、氨基酸和碱基等)以及氧气的要求。2．无菌技术(1)无菌技术的目的是防止外来杂菌的入侵。主要内容包括：①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。(2)消毒和灭菌：消毒灭菌概念使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌适用对象操作空间、操作者双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等3.大肠杆菌的纯化培养-2-(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基①最常用的细菌培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基配制步骤：计算―→称量―→溶化―→灭菌―→倒平板②培养基应采用高压蒸汽灭菌；倒平板时要待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近进行，等平板冷凝后将平板倒置。(2)纯化大肠杆菌①纯化培养的原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即获得较纯的菌种。②纯化培养方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上纯化大肠杆菌，最常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。ⅰ平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。ⅱ释释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。③培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱中，培养12h和24h后，分别记录观察。④菌种保存：临时保藏法甘油管藏法适用对象频繁使用的菌种长期保存的菌种培养基类型固体斜面培养基液体培养基温度4℃－20℃方法菌落长成后放入冰箱中保存，以后每3～6个月将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上将培养的菌液与等体积灭菌后的甘油混合均匀后放在冷冻箱内保存缺点菌种易被污染或产生变异1．判断对错(1)高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖。()(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。()(3)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。()提示：(1)×在高压灭菌的操作过程中，加热结束后应让灭菌锅内温度自然下降，待压力表的压力降到零时，打开放气阀，旋松螺栓，打开盖子。(2)×倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全取下放到一边。-3-(3)×接种环经火焰灼烧灭菌后应在火焰旁冷却后，再用其挑取菌落。2．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是()A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板C[制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，应先根据需要计算各成分用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板。]培养基及无菌技术[合作交流]1．虽然各种培养基的具体配方不同，但是一般都含有哪些成分？提示：虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子。另外，还必须满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。2．对培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶常采用的灭菌或消毒方法分别是什么？提示：分别为高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学消毒、紫外线灭菌、巴氏消毒法。3．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？提示：无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。[归纳总结]1．培养基的配制原则(1)目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用磷酸氢二钾－磷酸二氢钾。2．培养基的成分及功能营养物质作用功能主要来源碳源能为微生物代谢提供碳元素构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳-4-能源物质源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等氮源能为微生物的代谢提供氮元素合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子是生长必不可少的酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等水是生命活动所必需的不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定外界摄入无机盐为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂无机化合物3.几种常用灭菌和消毒方法的比较灭菌和消毒种类主要方法应用范围巴氏消毒法70～75℃煮30min或80℃煮15min牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体灼烧灭菌酒精灯火焰灼烧微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等干热灭菌干热灭菌箱160～170℃加热1～2h玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品高压蒸汽灭菌100kPa、121℃维持15～30min培养基及多种器材、物品煮沸消毒法100℃煮沸5～6min家庭餐具等生活用品的消毒紫外线消毒30W紫外灯照射30min接种室空气化学药物消毒用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒特别提醒：(1)用酒精消毒时，体积分数为70%的酒精消毒效果最好，原因是浓度过高，菌体表面蛋白质凝固形成一层保护膜，酒精不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。-5-(2)接种室、接种箱和超净工作台在使用前，可以用紫外线照射以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。(3)芽孢是某些细菌生长到一定阶段，在细胞内形成的休眠体。孢子是某些微生物的繁殖体。(4)消毒和灭菌都是通过一定的理化手段，使病原体的蛋白质或核酸变性，失去活性。只是作用的条件不同，抑菌杀菌的程度不同。[典题通关]下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是()原料①②③④蛋白胨/g10101010乳糖/g5555蔗糖/g5555KH2PO4/g2222伊红/g0.4美蓝/g0.065琼脂/g1020NaCl/g20蒸馏水/mL1000100010001000A.①③B．②①C．②④D．③①D[在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别是否存在大肠杆菌，有伊红和美蓝的培养基为鉴别培养基。高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将金黄色葡萄球菌分离出来，有高浓度食盐的培养基为选择培养基。](1)表格中的蛋白胨主要为微生物提供何种营养成分？(2)乳糖和蔗糖在培养基中的作用是什么？(3)如果用培养基培养某种自养微生物，则该配方中的哪种物质可以去除？提示：(1)主要为微生物提供碳源、氮源和维生素。(2)可以为微生物提供碳源和能源。(3)乳糖和蔗糖。1．关于灭菌和消毒的不正确的理解是()A．灭菌是指杀死环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子B．消毒和灭菌实质上是相同的C．接种环用灼烧的方法灭菌-6-D．常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌等B[消毒是指用温和的理化方法杀死体表或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)，灭菌则是用强烈的理化因素杀死体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。]2．空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；②制作无菌平板；③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题：(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。(2)步骤③中，实验组的操作是___________________________。(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。[解析](1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。(2)该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。[答案](1)牛肉膏、蛋白胨琼脂(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间(3)污染纯化大肠杆菌[合作交流]1．接种操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环或接种针，其目的分别是什么？提示：(1)划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌种。(2)划线结束后灼烧，能及时杀死接种环或接种针上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。2．在倒平板时为何要在酒精灯的火焰旁进行？提示：酒精灯的火焰旁是无菌区域，在酒精灯的火焰旁操作，可以避免周围环境中微生物的污染。3．接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？提示：培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被-7-污染了，需要重新制备。[归纳总结]1．平板划线法(1)操作步骤(2)注意事项①第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。②灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。③在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。④划线时最后一区域不要与第一区域相连。⑤划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。2．稀释涂布平板法(1)操作步骤①系列稀释操作：a．将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。b．用移液管吸取1mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡-8-皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀。c．从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复b步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。②涂布平板操作：(2)注意事项①每支试管及其中的9mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离酒精灯火焰1～2cm处。②涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃。③不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。④酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体。3．实验结果分析与评价(1)未接种的