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-1-EvaluationWarning:ThedocumentwascreatedwithSpire.Docfor.NET.1.1DNA重组技术的基本工具学习目标：1.了解基因工程的概念、诞生及发展。2.掌握限制酶及DNA连接酶的种类及作用。(重、难点)3.理解载体的种类及应具备的条件。(难点)一、基因工程及工具酶1．基因工程的概念(1)操作场所：生物体外。(2)操作技术：DNA重组和转基因等技术。(3)操作结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。(4)操作水平：DNA分子水平。2．基因工程的诞生与发展(连线)①DNA是遗传物质的证明②基因转移载体的发现③工具酶的发现A.基础理论④遗传密码的破译⑤DNA体外重组的实现⑥重组DNA表达实验的成功⑦PCR技术的发明B.技术支持⑧DNA双螺旋结构和中心法则的确立提示：①④⑧—A②③⑤⑥⑦—B3．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”(1)来源：主要来自原核生物。(2)种类：约4000种。(3)特点：具有专一性，表现在两个方面：①识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。②切割——特定核苷酸序列中的特定位点。(4)作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(5)结果：产生黏性末端或平末端。4．DNA连接酶——“分子缝合针”-2-种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点缝合黏性末端缝合黏性末端和平末端作用缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)种类①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的、环状的、裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。(2)目的①将目的基因转运到宿主细胞中去。②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。(3)必备条件①在宿主细胞中保存下来并大量复制。②有多个限制酶切割位点。③有一定的标记基因，便于筛选。④对受体细胞无害。2．重组DNA分子的模拟操作(1)材料用具：剪刀代表EcoR_Ⅰ，透明胶条代表DNA连接酶。(2)切割位点①分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出G—A—A—T—T—C序列，并选G—A之间作切口进行“切割”。②再从另一条链上互补的碱基之间寻找EcoRⅠ相应的切口剪开。(3)操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端应能互补配对；否则，说明操作有误。1．判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)(1)基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。()(2)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。()(3)DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。()(4)限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。()(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。()(6)DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。()-3-(7)载体的种类有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。()提示：(1)√(2)×载体是DNA重组技术所需的工具，不是工具酶。(3)×DNA重组技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，没有DNA聚合酶。(4)×限制酶在原来的原核细胞内用于切割外源DNA，使之失效，从而保护自身。(5)√(6)×E·coliDNA连接酶不能连接平末端。(7)√2．下列哪项不是基因工程中经常使用的运载目的基因的载体()A．细菌质粒B．λ噬菌体的衍生物C．细菌核区中的DNAD．动植物病毒C[细菌核区中的DNA是大型环状DNA，不宜做载体；常用载体为细菌质粒、λ噬菌体的衍生物以及动植物病毒等。]3．基因工程技术也称为DNA重组技术，其实施必须具备的四个必要条件是()A．目的基因限制酶载体受体细胞B．重组DNARNA聚合酶限制酶连接酶C．工具酶目的基因载体受体细胞D．模板DNAmRNA质粒受体细胞C[基因工程是把供体生物的基因(目的基因)导入受体(细胞)，并使其成功表达，以使受体获得新的遗传特性的过程。因此该过程需要有目的基因、受体细胞及工具(工具酶和载体)。]基因工程的概念背景材料我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉，就是通过精心设计，用“分子工具”构建成的。培育抗虫棉首先要在体外对含有抗虫基因的DNA分子进行“切割”、改造、修饰和“拼接”，然后导入棉花体细胞内，并使重组DNA在细胞中表达。[思考交流]1．填写下表，理解基因工程的概念。手段通过体外________和________等技术，赋予生物以新的________目的按照人们的愿望，创造出更符合人们需要的新的________和________设计和施工水平____________水平-4-提示：DNA重组转基因遗传特性生物类型生物产品DNA分子2．不同生物的DNA能够拼接成功的基础是什么？提示：都由四种脱氧核苷酸组成，都具有规则的双螺旋结构。3．一种生物的基因能在另一种生物的细胞中成功表达的基础是什么？提示：所有生物共用一套遗传密码。[归纳总结]1．基因工程的原理是基因重组自然状态下基因重组有两种情况：减数第一次分裂前期四分体的非姐妹染色单体间的交叉互换和减数第一次分裂后期非同源染色体的自由组合。基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的基因重组。2．基因工程的理论基础(1)拼接的基础①基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。②空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。③碱基配对方式相同：不同生物的DNA分子中两条链之间的碱基配对方式均是A与T配对，G与C配对。(2)表达的基础：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内可表达出相同的蛋白质。3．基因工程可以按照人们的意愿，定向改造生物的遗传特性，从而产生定向的变异，并可实现不同物种间的基因交流，打破生殖隔离。应与现代进化论中的“变异是不定向的”“物种间存在生殖隔离”区分开来。1．科学家经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是()A．定向提取生物体的DNA分子B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”C．在生物体外对DNA分子进行改造D．定向地改造生物的遗传性状D[该题的关键词是“最终目的”，A、B、C三项都是基因工程的技术手段，这些手段的目的是定向改造生物的遗传性状，故选D项。]2．下列叙述符合基因工程概念的是()A．在细胞内将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性-5-B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上B[基因工程是在生物体外将DNA进行重组，赋予生物以新的遗传特性，A错误；B项符合基因工程的概念；C项属于诱变育种；D项外源基因导入细菌不是人为操作的，不属于基因工程的范畴。]基因工程的工具酶背景材料[思考交流]1．DNA分子中磷酸与脱氧核糖是如何连接的？该化学键的名称是什么？提示：DNA分子中磷酸与脱氧核糖交替连接。其中同一核苷酸内部磷酸与脱氧核糖的5号碳相连，相邻两核苷酸之间磷酸与3号碳相连。连接形成的化学键叫磷酸二酯键。2．限制酶的作用特点是什么？所识别的序列有何特点？作用后的结果有哪两种形式？提示：(1)一种限制酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并在特点的位点上切割DNA分子。(2)限制酶所识别的序列一般都具有反向对称重复排列的特点。(3)黏性末端和平末端。3．DNA连接酶的作用是什么？提示：将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段之间的磷酸二酯键连接起来“缝合”成新的DNA分子。[归纳总结]1．限制性核酸内切酶(限制酶)(1)来源主要从原核生物中分离纯化而来。(2)特点①具有专一性，表现在以下两个方面：-6-a．能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列；b．切割特定序列中的特定位点。②大多数限制性核酸内切酶的识别序列由6个核苷酸组成，但也有少数限制性核酸内切酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。(3)识别序列的特点呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线(如图)，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；为轴，两侧碱基互补对称。中轴线(4)作用结果：限制酶切割DNA产生的DNA末端有黏性末端和平末端两种形式。①黏性末端是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：②平末端是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：特别提醒：1限制酶是一类酶而不是一种酶。2限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。3不同种类的限制酶识别的序列与切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。4在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割2次，产生4个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的末端。5限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数-7-由4、5或8个核苷酸组成；后者是双链序列。6判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180°，若与另一个完全相同，则说明这两个末端是由同一种限制酶切割产生的。2．DNA连接酶(1)作用：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。(如图)DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。(2)DNA连接酶的种类和特点种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只能连接双链DNA片段互补的黏性末端既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率较低(3)DNA连接酶与DNA聚合酶的比较项目DNA连接酶DNA聚合酶作用实质都是催化形成磷酸二酯键是否需要模板不需要需要连接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键作用结果将两个DNA片段连接成重组DNA分子合成新的DNA分子特别提醒：DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口连接起来，因此DNA连接酶不需要模板。两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能通过DNA连接酶拼接起来；平末端只能用T4DNA连接酶连接。(4)DNA连接酶与限制性核酸内切酶的比较①区别作用应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断用于提取目的基因和切割载体-8-裂DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接②联系1．下表所示为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，正确的是()注：Y＝C或T，R＝A或G。A．限制酶切割后不一定形成黏性末端B．限制酶的切割位点一定在识别序列的内部C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列A[由表中信息可知，HindⅡ能识别4种不同的核苷酸序列；Sau3AⅠ酶的切割位点在识别序列的外部；BamHⅠ酶与Sau3AⅠ酶切割后能形成相同的黏性末端；SmaⅠ酶切割后产生的是平末端。]2．下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是()A．T4DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来B．E·coliDNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸C[DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接起来。E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。]-9-基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”背景材料下图为大肠