2组织培养第二章植物组织培养基本操作

第二章植物组织培养基本操作宜职院08.9目的与要求了解植物组织培养的培养基种类、成分及其特点，学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条件，以及炼苗移栽基本方法。具有植物组织培养基本操作程序的认知。能够识别各类培养基特点，熟悉MS培养基成分；具有制作培养基能力，具有选择外植体、表面灭菌、无菌接种等基本能力；具有植物组织培养条件控制基本能力；有进行组培苗驯化练苗的基本能力。第一节培养基成分、种类及特点第二节培养基的制备第三节外植体无菌接种第四节外植体培养第五节试管苗的驯化与移栽组织培养步骤图（1）准备阶段查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制定出切实可行的培养方案。根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。（2）外植体的选择与消毒选择合适的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进行消毒处理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上。（3）启动培养接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。（4）增殖培养分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的增殖培养基经反复多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的还要进行病毒检测。（5）生根培养刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗生根，提高其健壮度。（6）炼苗移栽选择生长健壮，有3～5条根的生根苗进行炼苗，移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗完全成活后，再移向大田。拟定培养方案外植体预处理外植体无菌接种启动培养分化出芽、胚状体或原球茎继代增殖培养生根培养炼苗移栽成活供生产使用植物组织培养的一般程序培养基配制灭菌第一节培养基成分、种类及特点植物生长必需16种基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。离体培养条件下，各元素主要从培养基中获得：H和O来源于水，C来源于添加的糖类，其它矿质元素来源于组成培养基的无机盐。培养基是根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。一、培养基的成分培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调节剂三大基本组成成分。1、无机盐类功能离体组织生长发育的基本成分根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两类：大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十-几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。微量元素—植物所需元素的浓度小于10-5～10-7mol/L，Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。除C、H、O外，其它矿质元素通常以离子态吸收N-硝态氮和铵态氮2、有机化合物培养基中只有无机盐叫做基本培养基，为使培养物更好的生长，还需添加有机成分，常用有糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等。⑴糖类功能离体培养物生长与发育不可缺少的有机成分，即作为碳源，又维持培养基的渗透压在1.5-4.1MPa。多使用蔗糖，试管苗生长与繁殖浓度2-3%，幼胚培养4-6%，某些特殊培养中用8-10%。细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖。⑵维生素类功能参与酶的形成、蛋白质、脂肪代谢，明显的促进离体培养物的生长。盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、生物素-VH、维生素C-Vc。⑶肌醇功能促进糖的转化、维生素和激素的利用，对胚状体和芽的形成有良好影响。用量一般50-100mg/L。⑷腺嘌呤合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细胞分裂，促进芽的形成和生长。⑸氨基酸蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。⑹其它复合成分成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。3、生长调节物质⑴生长素类功能促进细胞脱分化和细胞伸长，诱导愈伤组织产生生长素与细胞分裂素协调作用，在离体培养中，生长素促进根的形成，抑制芽的形成。液体培养中利于体细胞胚胎发生。常用IAA、IBA、NAA、2,4-D。IBA促进生根细胞分裂素的生理效应⑵细胞分裂素类功能促进细胞分裂和扩大，调节器官分化，延缓组织衰老，增强蛋白质合成。离体培养中，促进不定芽的发生，与生长素协调作用可有效控制培养物的生长与分化。常用6-BA、ZT、KT、2iP。植株的形态建成是CTK和IAA的比值调控的CTK/IAA高，诱导愈伤组织形成芽CTK/IAA低，诱导愈伤组织形成根烟草在不同细胞分裂素与生长素浓度下的生理效应⑶赤霉素类功能促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠以及诱导单性结实等。与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞胚进一步发育成植株。有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。4、水离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用双蒸水或超纯水大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净水。5、其它附加成分⑴琼脂功能来自海藻的多糖类物质，组织培养中最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支持物。常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。卡拉胶海藻提取物，含杂质少纯度更高，凝固后培养基透明，利于材料观察。⑵活性炭功能常用的吸附剂，某些培养类型中，可以吸附培养过程中产生的一些有毒物质（酚类物质），有利于培养物的生长。常用浓度1～5mg/L左右其吸附作用选择性较差，使用应慎重。常受温度影响，低温吸附效果好，高温吸附能力降低甚至解吸附。⑶抗生素培养基中添加抗生素可防止菌类污染，常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量一般为5～20mg/L。大部分抗生素需要过滤除菌。⑷抗氧化物抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及抗坏血酸（Vc），可用50～200mg／L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤除菌后加入固体培养基的表层。二、常用培养基的种类、配方及特点（一）培养基种类1、根据态相分：固体培养基-加凝固剂的培养基液体培养基-不加凝固剂的培养基。2、根据培养过程分：初代培养基-初次接种外植体的培养基。继代培养基-接种初代培养之后培养物的培养基。3、根据作用分：诱导培养基-诱导外植体启动生长增殖培养基-诱导离体培养苗扩大繁殖。生根培养基-诱导离体培养苗生根4、根据营养水平分：基本培养基-包含无机盐等基本营养成分。完全培养基-包含使植物离体生长全面营养。（二）几种常用培养基细胞工程常用的基本培养基有：MS、MT、White、Nitsch、Blaydes、N6、B5、NT、SH、Miller、Heller等。（三）几种常见培养基的特点1、富盐平衡培养基无机盐浓度高，元素比例适当，离子平衡好，具有较强的缓冲性，培养中维持较好的稳定性，含高量氮、钾，营养丰富，元素种类齐全，MS培养基使用最广泛。2、低盐培养基无机盐浓度低，有机成分含量低，多数作为生根培养基、胚胎培养使用，常用White培养基。3、高硝态盐培养基较低铵盐，高硝酸盐和盐酸硫胺素B5培养基适合双子叶植物特别是木本植物的生长。N6培养基为水稻等禾谷类花药培养设计，KNO3和（NH4）2SO4含量高,不含钼。SH培养基(NH4)H2PO4代替（NH4）2SO4,矿质浓度较高，多数单子叶和双子叶植物上使用较好。4、中盐培养基大量元素无机盐为MS的1/2，微量元素种类减少含量增高，无肌醇维生素种类多，增加生物素、叶酸，有H、Hitsch、Miller、Blaydes等培养基，适用于特殊细胞培养。第二节培养基的制备制作一升培养基所需药品20多种，为节省时间和配制的准确，需将各种药品浓缩成一定倍数，并且混合成一定母液，进行保存。制作培养基时根据需求制培养基数量取用母液。一、培养基母液的配制（一）营养成分的配制根据药品性质将母液配制成以下四类：1、大量元素可以混在一起配制成10—20倍液，硫酸镁和氯化钙Ca２+和Mg2+会与磷酸盐混合，产生不溶性沉淀，要分别单独配制Ca２+与PO4-一起混合易沉淀，定容后消失。2、微量元素可配成100—200倍混合母液，KI可单独配。3、铁盐硫酸亚铁和EDTA钠盐易沉淀，需单独配制，配成100—200倍鳌合剂不易沉淀。4、有机化合物维生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或200倍液，也可分别配制。（二）植物生长调节物质的配制植物生长调节物质分别配成母液储于冰箱，浓度一般为0.5－1mg/ml。1、IAA、NAA：先用少量95%酒精使之充分溶解。2、2,4－D：可用少量0.1mol/L的NaOH溶液充分溶解，再缓缓加蒸馏水定容至需要的体积。3、KT和BA等细胞分裂素类：先用少量0.1mol/L的HCl溶解，再用蒸馏水定容至需要的体积。（三）药品用量的计算：配制母液时药品用量(mg)=配方用量(mg)×浓缩倍数×制备容量（L）二、培养基的制作（一）母液取用量的计算制备培养基时母液取用量（ml）=1000÷浓缩倍数×制备培养基数量（L）（二）培养基制作程序1、按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分顺序将母液取出，混合。2、适量蒸馏水放入加热容器，蒸馏水应少于所制培养基数量，约终体积的2/3-3/4，接通电源加热。3、向加热容器中加入称量好的琼脂（0.6-0.8%），搅拌加热，至完全溶化。培养基制作程序图4、琼脂熬化后，称取相应量的蔗糖（2-3%），加入加热容器中至溶解。5、将母液混合液加入到加热容器中，搅拌混匀。6、蒸馏水定容至所需体积。7、测试培养基溶液的PH值(5.8-6.0)，过高滴加0.1mol/L的HCL调整，过低滴加0.1mol/L的NaOH调整。8、迅速分装到培养瓶中，备用。培养基是离体培养物赖以生存和生长的人工环境的重要组成部分，常用的培养基依据其物理状态的不同分为固态培养基和液态培养基。固态培养基一般使用琼脂为凝固剂，也有使用卡拉胶或魔芋粉为凝固剂的。液态培养基不使用凝固剂，但需要在容器中置入适当的支撑物，试管为培养容器的支撑物可用滤纸桥，底面积较大的培养容器，支撑物可选用脱脂棉等。固体培养基三、培养基及培养器械的灭菌制备好的培养基如果带菌，会导致植物离体培养失败，因而还要对培养基进行灭菌处理。（一）高压蒸汽灭菌培养基的灭菌一般采用湿热灭菌法：1、培养瓶及培养器械放入高压灭菌锅。2、灭菌锅加水至淹没电热丝。3、封闭高压灭菌锅各出气口。4、接通电源加压至49kPa（0.05MPa）5、打开排气阀，排冷气至压力0kPa。6、继续加压至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃）7、压力至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃）时，稳压在此压力15-20min。8、关闭电源自然冷却至压力为0kPa。9、取出培养基和器械冷却，贮存于30℃以下室内。（二）干热灭菌培养瓶、三角瓶、试管等玻璃器皿及接种器械，可以进行干热灭菌。即将洗涤干净的玻璃器皿放到烘箱中，在150℃温度下，干热灭菌1小时，或120℃下灭菌2小时。灭菌完毕冷却后取出器械贮存。贮存室要保持无菌、干燥、以免造成培养基的二次污染。灭菌后的培养基一般应在2周内使用，时间过长易造成潜在的污染。培养基灭菌后如果出现过多沉淀或琼脂不凝固等现象，该培养基不能继续使用，应查明原因重新配制。第三节外植体无菌接种一般来说，无论何种类型的细胞工程技术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种与培养等基本过程。一、植物材料的培养与取材外植体—是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料，是植物离体培养的基础材料。1、外植体的来源-生长在自然环境下的植物-有目的地培育在温室控制条件下生长的植物-无菌环境下已经过离体培养的植物自然环境中生长的植株，一般带有微生物，甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生菌。取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养效果。自然环境生长植株温室控制条件下生长植株已离体培养植株多数情况下，应尽量使用温室