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1实验1大肠杆菌的培养和分离[学考报告]知识内容考试属性考情解读大肠杆菌的培养和分离加试1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理一、大肠杆菌1．大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。2．在肠道中，大肠杆菌一般对人无害，但也有一些菌株可以侵袭肠黏膜并产生毒素，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。3．大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。二、实验内容1．本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。2．本实验用LB液体培养基(通用的细菌培养基)扩大培养大肠杆菌。培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。三、细菌的培养和分离1．细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。人们在培养细菌时，一般用接种环转移带菌的培养物。接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，再操作。2．细菌的分离(1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养8h，每毫升培养基中就有几亿个细菌。可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线到最后，可使细菌间的距离加大。在固体培养基培养10～20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释10－5～10－7倍，然后取0.1mL稀释度2不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养。在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。(3)细菌的两种分离法各有优点，都可采用。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。四、灭菌操作1．各种器皿必须是无菌的：实验用具用牛皮纸或报纸包好，所有容器都先封口，然后进行高压蒸汽灭菌(1kg/cm2压力、121℃、15min)处理，并在超净台上使用。注意：实验中所需棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水。2．各种培养基必须是无菌的。3．细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。注意：培养皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤1．在两个250mL三角瓶中分别装入50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基，加上封口膜。将培养皿包好，连同培养基一同灭菌15min。2．灭菌后待培养基冷却至60℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶，左手拿培养皿，并将培养基倒入4个培养皿中，将培养皿置于水平位置上，待其凝固。3．扩大培养先将接种环在酒精灯火焰上烧红，再深入到大肠杆菌斜面，使环冷却后，取菌体，并将菌体放入三角瓶液体培养基中，封瓶后在37℃每分钟200转的摇床上振荡培养12h。4．划线分离用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到在摇床上培养后的菌液中，然后在固体培养基的平板上连续划线，接种环需蘸菌液1次，划线后盖好皿盖，将培养皿倒置，在37℃恒温培养箱中培养12～24h后，可在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。5．在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱中保存。1．如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？提示：(1)胆大心细，操作快捷；(2)注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率；(3)注意微生物生长条件，如pH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37℃；霉菌喜酸，喜糖，喜25～30℃。2．在培养后如何判断是否有杂菌污染？提示：(1)从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠、颜色等，是区别细菌、酵母菌、3放线菌和霉菌关键指标；(2)显微镜观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌关键指标；(3)上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。3．进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置？提示：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较大，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4．实验完成后，接种过细菌的器皿应如何处理？提示：所有接触过细菌的器皿都要先高压蒸汽灭菌后再洗涤(特别是培养基)；使用后的废弃物也要高压蒸汽灭菌后再抛弃。5．如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通的大肠杆菌所污染？提示：转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。微生物培养的基本条件1．培养基(1)含义：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)种类划分标准培养基种类特点用途物理液体培养基不加凝固剂工业生产性质半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类、鉴定固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入鉴别不同种类的微生物4某种指示剂或化学药品(3)成分：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等最基本的物质，有时还需要加入特殊的营养物质。2．无菌技术(1)含义：无菌技术不仅能防止实验室的培养物被其他外来微生物污染，保持微生物的纯培养，而且在分离、转接时亦能防止其他微生物污染。(2)无菌操作①对实验空间、操作台可用紫外线或酒精消毒，操作者的手用酒精消毒。②实验用的培养器皿和培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，接种环用灼烧方法灭菌。③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。(1)不同种类微生物需要的培养基不同，但各种培养基配制完成后均需严格灭菌。(2)培养基灭菌通常采用高压蒸汽灭菌法，但如果培养基中含有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2压力(90℃以上)灭菌30min；有些不能加热灭菌的化合物，如尿素等只能用G6玻璃砂漏斗过滤。(3)配制固体培养基时，需要添加凝固剂，如琼脂，但凝固剂不止琼脂一种。1．下列有关微生物培养条件的叙述，不正确的是()A．分离微生物常用固体培养基，扩大培养常用液体培养基B．“细菌喜荤，霉菌喜素”，培养基中成分的含量和配比因培养物而异C．培养基的灭菌均采用高压蒸汽灭菌法，即在121℃(1kg/cm2压力)下灭菌15minD．制作固体培养基时常常加入琼脂解析：选C。培养基的灭菌通常是采用高压蒸汽灭菌法，但因培养基的成分而异。如培养基中有葡萄糖，高压蒸汽条件下会导致葡萄糖分解碳化，而采用500g/cm2压力灭菌30min。2．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、用酒精棉球擦拭、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌()A．接种环、手、培养基B．高压锅、手、接种环C．培养基、手、接种环D．接种环、手、高压锅解析：选C。高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物接种工具的灭菌，如接种环。5消毒和灭菌的比较项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物煮沸消毒法日常用品紫外线消毒法接种室、超净台化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属工具高压蒸汽灭菌法培养基及容器灭菌过滤灭菌不能加热灭菌的化合物，要用G6玻璃砂漏斗过滤大肠杆菌的培养和分离1．LB培养基的制备(1)计算：根据LB培养基配方的比例，计算配制50mL的培养基时各种成分的用量。(2)称量：准确地称取各种成分。即：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g，加水50mL。(如配LB固体培养基，则再加1g琼脂)(3)制备空白斜面：将LB液体培养基配好，加入琼脂并加热使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，每试管2mL，加棉塞并将试管捆在一起，上端加盖一张牛皮纸，灭菌。灭菌后斜靠在平放的铅笔上，冷却后即成空白斜面培养基。2．进行大肠杆菌培养与分离操作(1)灭菌250mL三角瓶甲→50mLLB液体培养基250mL三角瓶乙→50mLLB固体培养基（尚未凝固）牛皮纸包好的培养皿置于灭菌锅1kg压力灭菌15min(2)制备LB固体平面培养基——倒平板操作6待培养基冷却至60℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体操作描述如下：(3)扩大培养①左手持大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶，右手拿接种环并用无名指、小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。②将接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使其冷却后取菌体。③将菌体放入三角瓶液体培养基中(将封口膜及斜面棉塞复原)。④三角瓶在37℃摇床振荡培养12h。(4)划线分离①取种在酒精灯火焰上灼烧接种环，将上述培养后的菌液打开，接种环部分深入到菌液中取种。②平板划线操作在LB固体培养基的平板上连续划线(如下图所示)，划线后盖好培养皿。③培养将上述划线操作后的培养皿倒置放至37℃恒温培养箱中培养12～24h，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。(5)菌种纯化与保藏在无菌操作下，将单菌落用接种环取出，再用划线法接种至斜面上，37℃培养24h7后，4℃冰箱保存即可。划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，以期在连续划线后，可以分离到由单个细胞繁殖而来的子细胞群体(菌落)，从而达到纯化菌种的目的，为此，在划线操作时，接种环只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的划线操作时，须从上一次划线的末端划线——如此可使菌体数量随划线次数的增加而减少，并逐步分散，最终实现在平板上得到单菌落的目的。请结合图示，回答下列有关大肠杆菌分离与纯化的问题：(1)稀释用1mL无菌吸管吸取1mL大肠杆菌培养液，加入到盛有9mL________的大试管中，充分混匀，稀释________倍；按照同样的方法依次进行稀释制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6系列稀释度的大肠杆菌稀释液。(2)划线或涂布①划线分离法a．操作：在________旁，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线。b．划线方法：________划线和________划线。c．平行划线时，第一次划线及每次划线之间都要灼烧接种环，划线结束后也要灼烧接8种环，目的分别是什么？②涂布分离法a．操作：取0.1mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上，然后进行培养。b．图示：(3)培养：将接种的平板________于培养箱或温室中37℃培养12～24h。答案：(1)无菌水10(2)a.酒精灯火焰b．平行连续c.第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束时灼烧目的杀死接种环上原有的微生物杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线后菌种数目减少杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者(3)倒置大肠杆菌培养和分离的注意事项①在倒平板过程中，不能将培养基溅在皿壁与皿盖上，防止杂菌污染。②本实验需设置空白培养基在相同条件下一起培养，以确定是否有杂菌污染。③培养皿倒置的目的是防止皿盖上的水珠落入培养基中难以形成单菌落。④实验操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留