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1实验5加酶洗衣粉的使用条件和效果(略)实验6α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测[学考报告]知识内容考试属性考情解读α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测加试1.尝试用吸附法制作固定化α淀粉酶。2．运用固定化α淀粉酶进行淀粉水解的测定。3．说明酶固定化的方法及制作原理。4．通过此实验探讨固定化酶的应用价值一、酶与固定化酶1.酶的定义酶是活细胞产生的具有催化作用的一类有机物，它是生物体内各种化学反应的催化剂。大多数酶是蛋白质，少数是RNA。2.固定化酶将水溶性的酶用物理或化学方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。3.将酶改造成固定化酶的原因由于酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用，所以要将酶改造成固定化酶。4.酶固定化的方法：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。5.固定化酶作用的机理将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。二、淀粉水解的过程及其在淀粉指示剂下的颜色反应淀粉――→α淀粉酶糊精――→β淀粉酶麦芽糖――→糖化淀粉酶葡萄糖遇碘显蓝色遇碘显红色遇碘不显色遇碘不显色三、α淀粉酶的固定化及淀粉水解的实验1.实验原理(1)用吸附法将α淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂KII2指示液测试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。(2)本实验使用的酶是枯草杆菌的α淀粉酶，其作用的最适温度为50～75℃；最适2pH为5.5～7.5。2.实验步骤(1)淀粉溶液流经固定化酶柱：将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上，用滴管加淀粉溶液，使该溶液以0.3mL/min的流速过柱。(2)接取流出物：待从固定化酶柱中流出5mL的溶液后，接收0.5mL流出液。(3)流出物鉴定：在流出物中加入KII2溶液，观察颜色。用水稀释1倍后再观察颜色。(4)洗涤、保存固定化酶柱：实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱。放置在4℃冰箱中保存。(5)重复实验：几天后取出冰箱中该固定化酶柱，重复实验，观察结果。3.实验结果的比较1．如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶？提示：可在试管中加入1mL可溶性淀粉，再加几滴淀粉酶柱流出液，保温几分钟后用碘液检验。如仍显蓝色，则流出液中没有淀粉酶了。2．耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途？提示：可以在高温下使淀粉水解快，而且酶不会因高温而失活，所以可在一些需要高温加热同时又要水解淀粉的反应中使用。固定化酶的特点及固定方法1.特点固定化酶与游离酶相比不但稳定性好，而且与底物和产物容易分离，且易于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于自动化生产。固定化酶技术是在20世纪60年代发展起来的一项技术，很快在工业、医学和生化分析等方面得到了广泛应用。特点具体如下：(1)使酶固定化后有一定的机械强度，催化反应的过程可管道化、连续化和自动化。(2)酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易纯化。(3)固定化酶可反复使用，更经济，更利于工厂化生产。(4)固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间地贮存和使用。3(5)一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的。因此，在固定化酶技术的基础上，又发展出了固定化细胞技术。2.固定方法方法图示原理优缺点吸附法物理吸附法将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上①优点：适用的酶范围广，酶活性高②缺点：酶与载体的结合力较弱，酶容易脱落离子交换法利用蛋白质的两性性质，使其带有电荷的基团与离子交换剂形成离子键，而被交换结合至交换剂上续表方法图示原理优缺点共价偶联法将酶与聚合物载体以共价键相结合。酶中的氨基、羧基、巯基、羟基、咪唑基、吲哚基、苯环等常与载体共价结合，从而被固定①优点：都是结合稳定，适用范围广②缺点：都是制备条件不够温和，酶活性较低交联法使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法化学结将酶分子相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖，离子交很多情况下，与交联法几乎是等同的4合法换树脂等载体上的固定方式包埋法凝胶包埋法微胶囊包埋法酶被包埋成网格型，常用的载体有海藻酸钠凝胶①优点：酶活性高、稳定性也较高②缺点：适用范围小酶被包埋成微胶囊型，常用的载体有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素(1)吸附法固定酶应选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，对蛋白质有高度吸附能力的有机硅胶、多空玻璃、活性炭和石英砂等。(2)共价偶联法中参加共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性的非必需基团，如若共价结合包括了酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。(3)交联法使用的交联剂是水溶性化合物，其中使用最广泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生反应，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。交联法中酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。(4)吸附法和共价偶联法又可统称为载体结合法。1．下列关于固定化酶技术的说法中，正确的是()A．固定化酶技术就是固定反应物，让酶依附着载体围绕反应物旋转的技术B．固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应C．固定化酶中的酶无法重复利用D．固定化酶是将酶固定在一定空间的技术解析：选D。固定化酶是利用物理或化学的方法将酶固定在一定的空间内，将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以重复利用，这样既可以降低生产成本，提高产品质量，还可以减少环境污染，由于固定化酶只能固定一种酶，不可能催化一系列的酶促反应。2．下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，错误的是()A．固定化酶的主要目的是实现酶的重复利用B．溶解氧交换受阻是固定化酶应用的重要限制因素C．固定化细胞用于生产能分泌到细胞外的产物D．凝胶与被包埋细胞之间不是通过共价键结合5解析：选B。A项，固定化酶技术是指将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，可实现重复利用。B项，固定化酶发挥作用不需要供氧，溶解氧交换受阻不会成为其应用的限制因素。C项，固定化细胞只能用于生产分泌到细胞外的产物，否则无法获得需要的产品。D项，用凝胶包埋细胞利用的是物理方法。实验过程中的注意事项1.实验中要待固定化酶柱中流出5mL液体后再接收流出液用于鉴定。因为固定化酶柱中的酶与流经柱子的淀粉反应需要一定的时间，刚开始流出的液体中由于反应时间过短，糊精未生成或生成的量太少，所以不利于后面的颜色鉴定。2.本实验中选用石英砂来固定化酶。固定化酶有许多方法，本实验中采用的是吸附法。现已证明石英砂对固定化α淀粉酶、胰蛋白酶的作用效果较好。3.证明洗涤固定化淀粉酶柱的流出液中没有淀粉酶。可在试管中加入可溶性淀粉液，再加入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住试管使温度增加，几分钟后加入1～2滴KII2指示剂，如果混合液仍显蓝色，即可断定流出液中没有淀粉酶。用固定在石英砂上的淀粉酶柱再作用于淀粉液，使其自柱中流出，这样，作用的结果才能表明是淀粉酶的固定化酶作用的结果。4.使底物溶液通过装有固定化酶的柱，柱流出液即为酶催化的产物。有时也可将固定化酶或固定化细胞悬浮于底物溶液中，一定时间后溶液即被酶催化成产物。不管是固定化柱还是固定化悬浮体，回收后，在一定条件下贮存，都可以利用。5.控制滴灌流速。0.3mL/min的流速，即滴管流出量为每分钟6滴。这样做的目的是控制流速让淀粉和淀粉酶充分接触、反应。6.在流出5mL后接取0.5mL流出液，然后向试管中加入1～2滴KII2溶液。切记，KII2溶液不要加入太多，以免碘液颜色覆盖糊精淀粉反应后的颜色。1．淀粉在各种酶的作用下会依次水解，不同阶段的水解产物遇到指示剂会出现不同的显色反应，下列选项中属于本实验中的反应物质和显色现象的是()A．淀粉遇碘显蓝色B．糊精遇KII2溶液显红色C．麦芽糖遇碘不显色D．葡萄糖遇本尼迪特试剂显红黄色解析：选B。淀粉流经α淀粉酶固定化酶柱时，淀粉被酶水解成了糊精，而糊精遇到KII2溶液显红色。所以A、C、D选项中的物质都是错误的，不是淀粉、麦芽糖、葡萄糖，而是糊精。只有选项B正确。62．下列关于α淀粉酶的固定化过程的叙述，错误的是()A．首先要在烧杯中将5mgα淀粉酶溶于4mL蒸馏水中B．再将5g石英砂加入上述烧杯中，不时搅拌30minC．随后将烧杯中的物质装入1支下端接有气门心但并不封住的注射器中D．最后用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器，除去那些未吸附的游离淀粉酶解析：选C。α淀粉酶的固定化酶的制备应该是将烧杯中的物质装入1支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中，而不是不封住的注射器中。一、选择题1.酶的固定方法不包括()A．将酶吸附在固体表面上B．将酶相互连接起来C．将酶包埋在细微网格里D．通过基因工程改造酶答案：D2.下列不属于固定化酶在利用时的特点的是()A．可以被反复利用B．有利于酶与产物分离C．能自由出入依附的载体D．固定化酶的活性受外界环境因素影响较小解析：选C。固定化酶由于酶被固定在不溶性的载体上很容易与产品分离，同时酶也能反复使用，这是固定化酶的主要优点。固定化酶的化学本质和作用机理没有发生变化，其特性与正常酶是相同的。3.下列选项中是α淀粉酶固定化所采用的方法是()A．吸附法B．共价偶联法C．交联法D．包埋法解析：选A。固定化酶的方法包括吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法等。其中，α淀粉酶固定化所采用的是吸附法，所以A选项是正确的。4.α淀粉酶与其固定化酶的化学本质分别是()A．蛋白质、脂质B．蛋白质、蛋白质C．RNA、蛋白质D．RNA、脂质解析：选B。固定化酶是酶的衍生物，两者的化学本质是一样的。其中α淀粉酶的化学本质是蛋白质，因此其固定化酶的化学本质也是蛋白质。75.酶的固定有多种方法，其中，通过酶分子的侧链基团相互作用，形成共价键而连接起来的一种方法是()A．吸附法B．共价偶联法C．包埋法D．交联法解析：选B。共价偶联法是将酶与聚合物载体以共价键相结合。酶中的氨基、羧基等常与载体共价结合，从而被固定。6.酶的固定化常用的方式不包括()A．吸附B．包埋C．交联D．将酶加工成固体解析：选D。将酶加工成固体属于酶制剂，不属于固定化酶。固定化酶的方法主要有吸附法、交联法、包埋法、化学结合法等。7.下列属于固定化酶的优点是()A．有利于酶的活性B．有利于产物的纯化C．有利于提高反应速度D．有利于酶发挥作用解析：选B。将酶固定化使酶与产物易于分离、降低成本、提高产物的品质。8.下列不是用于包埋法固定化细胞的载体是()A．琼脂糖B．醋酸纤维素C．聚丙烯酰胺D．聚乙烯树脂解析：选D。用于包埋法的载体的特点是多孔性载体，不溶于水。9.研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得到的磷酸二酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可以用来降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的()A．温度B．pHC．水分D．营养解析：选D。酶不是生命有机体，不需要营养。10.用吸附法将α淀粉酶固定在石英砂上，当一定浓度的淀粉溶液流过固定化酶柱后，柱底端收集到的溶液中，加入KII2溶液，其颜色变化为()A．显蓝色B．显红色C．不显色D．流出液中因含淀粉酶，使得溶液颜色显紫色解析：选B。一定浓度的淀粉溶液流过固定化α淀粉酶酶柱后，淀粉可转化为糊精，糊精遇KII2溶液显红色，酶经固定化后，不能从柱底端流出。811.如图表示某同学进行的澄清苹果汁生产实验，下列相关叙述正确的是()A．实验中所用的固定化果胶酶只能利用吸附法获得B．为防止杂菌污染，图示装置制作完毕后应瞬间高温灭菌C．通过控制阀调节苹果汁流出的速率，保证反应充分进行D．固定化果胶酶不可重复使用，每次生产前应重新装填反应柱解析：选C。固定化酶获得的方法不只有吸附法；瞬间高温灭菌会造成果胶酶失活；固定化酶可反复多次使用。12.有关固定化酶和固定化细胞的说法，不正确的是()A．它们都受到外界pH的影响B．它们都受到外界温度的影响C．它们都需要从外界吸收营养物质D．要将微生物的发酵过程变成连续的酶促反应，应选择固定化细胞解析：选C。固定化酶不需要营养。13.下列图形依次表示包埋法、载