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1第15讲基因工程和细胞工程一、选择题1．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________________________(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是________；并且________和________的细胞也是不能区分的，其原因是________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________。解析：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。(2)依题意可知，目的基因插入后，导致四环素抗性基因(Tetr)失活，而氨苄青霉素抗性基因(Ampr)仍能行使正常功能。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，因二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插2入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因(Tetr)失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。(3)噬菌体是专门寄生在细菌细胞中的病毒，在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入到细菌细胞中，而蛋白质外壳仍留在细胞外；在噬菌体的DNA的指导下，利用细菌细胞中的物质来合成噬菌体的组成成分。据此可推知：基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。答案：(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞2．研究人员利用PCR技术扩增了目的基因，并培育了能合成凝乳酶的转基因酵母菌。请结合下图回答相关问题：注：HindⅢ和ApaLⅠ是两种限制酶，箭头表示酶的切割位点。(1)利用PCR技术扩增目的基因的原理是____________。图1中引物为单链DNA片段，它是根据________的脱氧核苷酸序列合成的。从理论上推测，第2轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________。(2)图2所示的基因表达载体中的URA3基因能编码乳清苷5—磷酸脱羧酶，该酶能催化酵母菌尿嘧啶的合成，若酵母菌缺乏乳清苷5—磷酸脱羧酶，就无法生长，除非在培养基中3加入尿嘧啶。利用URA3基因作为________基因来筛选转化成功的酵母菌，要选择________的酵母菌作为受体细胞，所使用的培养基________(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶。(3)奶酪生产中的凝乳酶是一种分泌蛋白。工业生产过程中，________(填“能”或“不能”)选用大肠杆菌作为受体细胞表达出凝乳酶，原因是_______________________________。答案：(1)DNA双链可进行复制目的基因3/4(2)标记缺乏URA3基因(或不能合成乳清苷5磷酸脱羧酶)不需要(3)不能大肠杆菌无内质网和高尔基体(或大肠杆菌无法对蛋白质进行加工和修饰)3．真核生物基因中通常含有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。下图表示基因文库的制备和从基因文库中提取胰岛素基因的过程。请回答下列问题：(1)从基因结构分析，与基因组文库中的基因相比，从cDNA文库中获得的目的基因缺少的结构______________________(至少写两个)等。图中①过程中存在的碱基配对方式有______________________(模板上的碱基在前)；②过程所用的工具酶有__________________。(2)为了便于导入基因，细菌培养基中一般加入________，理由是__________________。(3)依据图中杂交结果，应选取培养基上________(填字母)菌落继续培养，才能获得含有胰岛素基因的受体菌。(4)从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，从细胞结构角度分析，其原因是____________________________________________________。答案：(1)启动子、终止子、内含子A—T，U—A、G—C、C—G限制酶、DNA连接酶(2)CaCl2(或钙离子)钙离子使细菌处于感受态(或钙离子能提高细菌从外界吸收DNA的能力)(3)a(4)大肠杆菌中缺少对胰岛素进行加工和修饰的内质网和高尔基体4．利用基因工程技术培育马铃薯新品种，目前已经取得丰硕成果。请根据教材所学知4识，回答下列问题：(1)马铃薯易患多种疾病，导致其产量不高。通过导入抗病基因并使其表达可以提高马铃薯产量，基因工程中使用最多的抗病基因是________和病毒的复制酶基因。(2)马铃薯是双子叶植物，常用________法将目的基因导入马铃薯受体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构包括目的基因、标记基因、________、________、________等五部分。(3)科学家还培育出抗除草剂的转基因马铃薯，其设计方法：修饰除草剂作用的靶蛋白，使转基因马铃薯对除草剂________(填“敏感”或“不敏感”)，或使靶蛋白过量表达，转基因马铃薯吸收除草剂后仍能________。(4)将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行______________________。解析：(1)通过导入抗病基因并使其表达可以提高马铃薯产量，基因工程中作用最多的抗病基因是病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因。(2)马铃薯是双子叶植物，常用土壤农杆菌转化法将目的基因导入马铃薯受体细胞中，构建好的基因表达载体基本结构包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等五部分。(3)除草剂只能作用于杂草，不能作用于马铃薯，因此需要修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感(抵抗)，或使靶蛋白过量表达，植物吸收除草剂后仍能正常代谢。(4)将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行目的基因的检测与鉴定。答案：(1)病毒外壳蛋白基因(2)土壤农杆菌转化启动子终止子复制原点(3)不敏感正常代谢(4)目的基因的检测与鉴定5．基因表达载体的构建是基因工程的核心。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列示意图，图2表示目的基因及限制酶切点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。请回答下列问题：(1)图3为目的基因中的某一片段，连接②处化学键的酶有________________________。(2)若利用PCR技术增加目的基因的数量，由图2可知，A、B、C、D四种单链DMA片段5中除了B作为引物外，________(填“A”“C”或“D”)亦可作为引物。(3)为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，提高重组效率，应该选择的限制酶是__________________________。(4)如果大肠杆菌是受体细胞，则其体内应不含________，利于筛选出含重组质粒的受体菌。解析：(1)②处化学键是磷酸二酯键，在复制过程中连接②化学键的酶是DNA聚合酶，在基因工程中连接②处化学键的酶是DNA连接酶。(2)若用PCR技术增加目的基因的数量，由图2可知，DNA复制只能从5′到3′，因此构建前利用PCR技术扩增干扰素基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。(3)为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，提高重组效率，四环素抗性基因没有被破坏，所以应该选择的限制酶是EcoRⅠ和PstⅠ。(4)如果大肠杆菌是受体细胞，则其体内应不含抗四环素基因，以利于筛选出含重组质粒的受体菌。答案：(1)DNA聚合酶和DNA连接酶(2)C(3)EcoRⅠ和PstⅠ(4)抗四环素6．我国某科研团队将小麦液泡膜Na＋/K＋逆向转运蛋白基因(TaNHX2基因)转移到水稻细胞内，获得了转基因耐盐水稻新品种。请回答下列有关问题：(1)为保证目的基因在水稻细胞中能够表达，运载体上应含有特定的________(填“复制原点”“启动子”或“标记基因”)。(2)水稻的转化过程：将水稻幼胚接种到诱导培养基上，经过________过程，培养出愈伤组织，然后用________法，将目的基因和相关功能片段整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，最后诱导愈伤组织形成水稻植株。(3)为验证外源基因整合到水稻基因组后是否转录，可从转基因植株的细胞中提取所有mRNA并反转录成________再以反转录产物为模板，利用TaNHX2基因为特异引物，通过________技术进行基因扩增。若以根细胞为材料，扩增结果为阳性(有产物生成)，以叶细胞为材料，扩增结果为阴性(无产物生成)，则说明_______________________________________。(4)将生长至4叶期的转基因幼苗转入高浓度的NaCl溶液中培养，进行耐盐试验，用非转基因幼苗作为对照。培养30天后观察现象，若____________________，则说明转基因植株获得了耐盐特性。解析：(1)基因表达是指转录和翻译形成蛋白质，其中转录是由启动子启动的，因此为6保证目的基因在水稻细胞中能够表达，运载体上应含有特定的启动子。(2)愈伤组织是外植体经过脱分化过程形成的；将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。(3)mRNA反转录形成cDNA(互补DNA)；PCR技术可在体外扩增基因；若以根细胞为材料扩增结果为阳性(有产物生成)，以叶细胞为材料扩增结果为阴性(无产物生成)，则说明目的基因(TaNHX2基因)仅在根细胞中转录，未在叶细胞中转录。(4)将生长至4叶期的转基因幼苗转入高浓度的NaCl溶液中培养，进行耐盐试验，用非转基因幼苗作为对照，培养30天后观察现象，若转基因植株获得了耐盐特性，则转基因植株存活率高于非转基因植株(转基因植株叶片不变黄，非转基因植株叶片变黄，其它答案合理可给分)。答案：(1)启动子(2)脱分化农杆菌转化(3)cDNA(互补DNA)PCR目的基因(TaNHX2基因)仅在根细胞中转录，未在叶细胞中转录(仅回答“基因选择性表达”不正确)(4)转基因植株存活率高于非转基因植株7．请回答下列有关核移植方面的问题：(1)目前，科学家通过细胞核移植实验，培育出多种哺乳动物新类型。在牛的核移植实验中。一般通过________(物理方法)激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程；当胚胎发育到________阶段时，将胚胎植入代孕牛体内。(2)在利用核移植技术进行治疗性克隆时，需要取患者体细胞的细胞核，移入一个已经去核的卵母细胞中，构成重组细胞。这个过程中，所用的去核卵母细胞一般处于________期；所用的供体细胞一般选用传代10代以内的细胞，原因是_______________________________；将患者的体细胞核植入去核的卵母细胞中构建重组细胞后进行细胞培养，而不是直接用体细胞进行细胞培养的原