医学培训-生殖毒理学

2二、发育毒性和致畸性•发育毒性：个体在出生前暴露于受试物、发育成为成体之前（包括胚期、胎期以及出生后）出现的有害作用。——发育生物体的结构异常——生长改变——功能缺陷——死亡二、发育毒性和致畸性2、致畸作用的毒理学特点•发育各阶段毒性作用特点和致畸敏感期（一）着床前期分化前期，从受精时算起，到完成着床之前的一段时间。着床前丢失（preimplantationloss）：未分化细胞受化学毒物损伤而致胚泡死亡。二、发育毒性和致畸性器官结构畸形胚胎死亡吸收胎（resorption）流产致畸敏感期或致畸作用危险期(criticalperiod)（二）器官形成期孕体着床后直到硬腭闭合的一段时间二、发育毒性和致畸性（二）器官形成期各个器官发育最旺盛时感受性最强，不同器官的敏感期（targetwindow）不同，且有交叉重叠表现在器官形成期中不同时间给予致畸物会诱发不同器官畸形同一天染毒可引起多个器官受损反应停的敏感期：末次月经后第34到50天第35--37天：耳朵畸形和听力缺失第39--41天：胎儿上肢缺失第43--44天：双手呈海豹样3指畸形第46--48天：胎儿拇指畸形3二、发育毒性和致畸性(三)胎儿期器官形成结束后直到分娩的一段时间以组织分化、生长和生理学的成熟为基本特色接触发育毒物很可能对生长和功能成熟产生效应全身生长迟缓特异的功能障碍经胎盘致癌偶见死胎2、致畸作用的毒理学特点发育毒性剂量-反应模式和阈值问题发育毒性效应主要是胚胎致死，畸形和生长迟缓。其剂量-反应（效应）关系十分复杂，并且因化学物的类型，暴露的时间和剂量而改变。二、发育毒性和致畸性（1）除了在较高剂量几乎全窝胚胎死亡外，正常胎、生长迟缓和结构畸形同时存在发育毒性的剂量-反应模式（2）在远低于胚胎致死剂量下即可出现致畸，甚至全窝致畸发育毒性的剂量-反应模式（3）有生长迟缓和胚胎致死但没有畸形发生发育毒性的剂量-反应模式需要极大的样本数，难以用实验找出一个发生率很低的剂量-反应关系多数发育毒性机制还不了解，或支持或不支持阈值的存在发育毒性的阈值概念42、致畸作用的毒理学特点发育毒性的物种差异不同物种的致畸作用不一致种间差异：同一物种的不同品系之间存在差异个体差异二、发育毒性和致畸性3、致畸作用机理干扰基因表达基因突变与染色体畸变损伤细胞和分子水平的翻译细胞凋亡干扰细胞交互作用通过胎盘毒性引起发育毒性干扰母体稳态内分泌干扰作用二、发育毒性和致畸性干扰基因表达在培养的小鼠胚胎中用反义寡核苷酸探针抑制原癌基因Wnt-1或Wnt-3a，可产生中脑和后脑，或中脑、后脑和脊髓的畸形；剔除Wnt-1基因的突变小鼠也可产生中脑和后脑的畸形；向小鼠胚胎中加入鸡的-肌动蛋白启动子时，Hox-1.1基因表达，并产生多种颅脸部和颈椎的畸形。基因突变与染色体畸变诱变原具有潜在致畸性，如电离辐射、烷化剂、亚硝酸盐、多数致癌物都可能致畸.妊娠第13天的大鼠胚胎羊膜内注入CP及其两个代谢活化的致畸性产物PM或AC后，CP和AC引起了脑积水、露眼、腭裂、小领畸形、脐疝、尾部和肢部缺陷；而PM仅仅引起脑积水，尾部和肢部缺陷.研究已证实，自发流产的胚胎中至少50%存在染色体畸变.损伤细胞和分子水平的翻译细胞增殖率在个体发生过程中空间和时间都在变化，在胚胎中细胞增殖、分化和凋亡之间有精致的平衡。用CP处理妊娠第10天大鼠，引起胚胎的S-期细胞周期阻断，在细胞迅速增殖区域观察到细胞死亡.细胞凋亡程序性细胞死亡，指胚胎中在遗传基因的控制之下的特定类型的细胞死亡。凋亡对来自原基的结构的造型是必需的.部分致畸物，如细胞生长依赖激素、乙醇、抗癌药物都能促进细胞凋亡.5干扰细胞-细胞交互作用反应停的代谢活化产物引起胚胎细胞的粘连受体(adhesivereceptors)下调，阻碍发育过程中细胞与细胞和细胞与基质之间的相互作用，干扰了细胞之间的通讯从而导致肢芽结构异常.胚胎发育各个阶段都有不同的细胞通讯方式存在细胞通讯受破坏将影响正常的细胞生物学过程通过胎盘毒性引起发育毒性46个毒物有：镉(Cd)、砷或汞、香烟、乙醇、可卡因、内毒素和水杨酸钠等。Cd在妊娠中晚期通过引起胎盘毒性(坏死，减少血流)和抑制对营养物质的传送导致发育毒性。Cd诱导金属硫蛋白MT，MT对Zn有高度亲和力，干扰Zn转移通过胎盘。干扰母体稳态二氟苯水杨酸，引起兔的中轴骨骼缺陷。其发育毒性剂量引起严重的母体贫血并损耗红细胞ATP水平。妊娠第5天给单剂量的二氟苯水杨酸引起持续到第15天的母体贫血，而这正是缺氧引起类似的中轴骨骼缺陷的关键日子，胚胎中血药浓度低于母体的血药峰水平的5%。因此，二氟苯水杨酸对兔的致畸性或许是由于母体的贫血造成缺氧的结果内分泌干扰作用干扰激素的制造、释放、传送、代谢、结合、作用或排除的外源性因子。包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂、塑化剂、表面活化剂、有机金属、卤代杂环烃、植物雌激素等作用模式：作为类固醇受体的配体起作用改变类固醇激素代谢酶扰乱下丘脑-垂体激素释放目前还不清楚的模式作用4、传统的致畸试验（一）实验目的和原理母体在孕期受到可通过胎盘屏障的某种有害物质作用，影响胚胎的器官分化与发育，导致结构异常，出现胎仔畸形。因此，在受孕动物的胚胎的器官形成期给予受试物，可检出该物质对胎仔的致畸作用。检测娃振动物接触受试物后引起的致畸可能性，预测其对人体可能的致畸性。二、发育毒性和致畸性（二）实验步骤动物选择：原则上应选择动物体内代谢途径与人类似，胎盘结构也基本与人相近，妊娠期短而一致，产仔数多，而且自发畸形率较低的实验动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类首选家兔。选择健康成年未曾孕产的大鼠，体重200~250g。雌雄动物1:1(或2:1)晚上合笼，次日早晨对雌鼠阴道涂片检查，查见精子或发现阴栓者揭示已交配过，定为孕鼠，以这一天作为妊娠第0天计算妊娠日数。将查出的孕鼠按随机区组法分组，每组10~20只。6剂量分组：•试验至少设３个剂量组，同时设溶媒对照组；•高剂量组原则上应使部分动物出现某些发育毒性和（或）母体毒性，如体重轻度减轻等，但不至引起死亡或严重疾病，如果母体动物有死亡发生，应不超过母体动物数量的10％。低剂量组不应出现任何观察到的母体毒性或发育毒性作用。建议递减剂量系列的组间距２倍-４倍比较合适。当组间差距较大时（如超过10倍）加设1个试验组。剂量分组：•必要时设阳性对照组，常用经口给予的阳性对照物及参考剂量为敌枯双(0.5mg/kg体重-1.0mg/kg体重)、五氯酚钠(30mg/kg体重)、阿斯匹林(250mg/kg体重-300mg/kg体重)及维生素A(7500g/kg体重-13000g/kg体重视黄醇当量)等，或者用环磷肮胶（15mg／kg体重）于孕第12天腹腔注射１次。•曾用阳性物开展过致畸试验、并在所用实验动物种系有阳性结果发现，试验可略去设置阳性对照组。染毒：•在大鼠受孕的第6天~15天，灌胃体积-般不超过10m/kg体重，如为水溶液时，最大灌胃体积可达20mＬ/kg体重；如为油性液体，灌胃体积应不超过4mＬ/kg体重；各组灌胃体积一致。孕鼠状况观察：•每日对动物进行临床观察，包括皮肤、被毛、眼睛、粘膜、呼吸、神经行为、四肢活动等情况，及时记录各种中毒体征，包括发生时间、表现程度和持续时间，发现虚弱或濒死的动物应进行隔离或处死，母体有流产或早产征兆时应及时剖检。•在受孕第０天、给予受试物第１天、给予受试物期间每３天及处死当日称母体体重。若通过饮水途径给予受试物，还应记录饮水量。动物剖检：•鼠类有食畸形胎仔的习性，应在预期分娩的前一天处死母鼠进行检查(于大鼠妊娠第20天直接断头处死)。剖腹检查亲代受孕情况和胎体发育。迅速取出子宫，称子宫连胎重，以得出妊娠动物的净增重。记录黄体数、早死胎数、晚死胎数、活胎数及着床数。常用实验动物妊娠期和致畸敏感期（平均）动物妊娠（天）致畸敏感期（妊娠天数）金黄地鼠164-14小鼠205-15大鼠216-15兔316-18猫635-12狗638-28豚鼠6811-20胎仔检查：鉴别并记录每窝胎仔中活胎数、晚期死胎数、早期死胎数、吸收胎数及各种胎仔的特征。逐一记录胎仔外观所见，对活胎仔要测量其体重、体长和尾长。必要时记录活胎仔的性别（生殖突与肛门间距离，雌胎仔约1mm，雄性约2mm）。7胎仔活产，死亡和吸收的特征颜色器官外形自然运动对机械刺激的反应胎盘活产胎仔肉红色完整成形有有运动反应红色，较大晚期死胎灰红色完整成形无无运动反应色灰红，较小早期死胎乌紫色未完整成形无----暗紫吸收胎暗紫或浅色点块不能辨认胚胎--------不能辨认胎盘胎仔外观畸形检查：部位检查项目部位检查项目部位检查项目头部无脑头部小顿症躯干部短尾、卷尾脑膨出下顿裂无尾顶骨裂口唇裂四肢多肢脑积水躯干部胸骨裂无肢小头症胸部裂短肢颜面裂脊椎裂半肢小眼症腹裂多趾眼球突出脊椎侧弯无趾无耳症脊椎后弯并趾小耳症脐庙短趾耳低位尿道下裂缺趾无顿症无工门胎仔内脏畸形检查：致畸实验中可见的主要内脏畸形或异常头部胸部腹部嗅球发育不全左位心肝分叶异常无脑右大动脉弓无肾脑室扩张心房(室)中隔缺损肾积水脑室积液食管闭锁马蹄肾无眼球肺发育不全输尿道积水小眼球肺叶融合无膀胱鼻中隔缺损膈疝无睾丸或无卵巢、子宫或子宫不全结果评定1.母鼠妊娠期体重变化2.平均着床数3.平均活胎率4.着床后死亡率（％）＝5.活胎仔平均体重、体长、尾长100着床数死胎数吸收胎数6.畸形（外观、内脏及骨骼）总数。畸胎出现率，不同类别畸形出现率。7.畸胎出现率（％）＝8.活胎仔畸形率（％）＝9.母体畸胎率（％）＝100受检胎仔总数出现畸形胎仔总数100活胎仔总数畸形总数（活胎）100妊娠母体总数出现畸胎的母体数结果评定•注意：在计算畸胎总数时，每一活胎仔出现一种或一种以上畸形均作为一个畸胎。计算畸形总数时，同一胎仔出现一种畸形作为一个畸形计算，出现二种或二个畸形，则作为二个畸形计算，依此类推。结果评定8GB15193.14-2003•数据处理•结果判定致畸指数10以下——不致畸10-100——致畸100以上——强致畸致畸危害指数大于300——该物对人危害小100-300——中等小于100——大.体内预筛试验（C.K.试验）原理：大多数出生前受到的损害将在出生后表现为存活力(存活率)下降和(或)生长迟缓。观察出生3天内的新生仔外观畸形、胚胎致死、生长迟缓等发育毒性表现，对新生子代进行外部畸形、生长和生存能力的评估。体外替代发育毒性实验细胞培养器官培养胚胎培养（三）雄性生殖毒性1、雄性生殖细胞的发生过程精子的发生过程是指精原细胞发育成为成熟精子的过程.原始生殖细胞精原细胞初级精母细胞次级精母细胞精子细胞成熟精子输精管附睾精囊精原细胞成熟的精子64天初级精母细胞（上百个）精原细胞（1个）次级精母细胞精子细胞精子有丝分裂第一次减数分裂第二次减数分裂精子的发生（spermatogenesis）图3生精上皮与睾丸间质模式图9睾丸间质细胞次级精母细胞初级精母细胞精原细胞肌样细胞支持细胞精子细胞管腔精子图4生精小管和睾丸间质模式图2、外源化学物的雄性生殖毒性睾丸的功能：生成精子合成雄激素功能调节：下丘脑-垂体-睾丸轴对睾丸生精细胞的影响棉酚：黄色酚类色素，精子减少、不育二硫化碳（CS2）：睾丸萎缩、精子生成障碍铅/镉/汞/锰：畸形精子增多、正常精子数目减少农药：精子减少、畸形精子增多、正常精子数目减少、性功能减退2、外源化学物的雄性生殖毒性对内分泌功能的影响下丘脑：促性腺激素释放激素GnRH垂体前叶：促性腺激素FSH（卵泡刺激素）–促进精子的发生与成熟LH（黄体生成素）-刺激间质细胞的发育并分泌雄激素铅：FSH、LH、睾酮CS2：睾酮FSH、LH对性功能和生殖功能的影响3、雄性生殖毒性试验（1）精子分析精子分析是生殖毒性较为敏感的指标包括精子计数、精子运动能力以及精子形态的检查实验常用小鼠或大鼠收集精子的方法可采用交配射精后冲洗阴道的方式获取精子，但大多采用处死动物收集睾尾部和