8第八章原位杂交组织化学

第八章原位杂交组织化学原位杂交组织化学（ISHH）原理：用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。特点：杂交在载玻片上的细胞进行。分类：根据所用探针和靶核苷酸不同--DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、RNA-RNA杂交根据探针标记物是否直接被检测—直接法、间接法一原位杂交的由来与发展（一）核酸分子杂交技术按其作用方式大致分为液相杂交和固相杂交两种液相杂交：参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相分子杂交技术包括：①吸附杂交②发光液相杂交③液相夹心杂交④复性速率液相分子杂交固相杂交：是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交技术包括：①菌落原位杂交②斑点杂交法③Southern印迹杂交④Northern印迹杂交⑤组织原位杂交（二）原位杂交技术的发展在近20年飞跃发展的突出特点：①由分子遗传学研究提供的探针大量增加；②探针生产的可靠性和速率大大发展了；③非放射性标记物的发展使原位杂交技术成为实验室的常规技术和临床日常应用的诊断技术。④新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。二原位杂交组织化学基本技术原位杂交的基本方法和应用原则：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示（visualization）：放射性自显影显色、非放射性标记显色（一）原位杂交的基本要求1固定2玻片和组织切片的处理3杂交4杂交后处理5显示6对照实验和ISHH结果的判断1固定固定剂的应用和选择原则：①保持细胞结构；②最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平；③使探针易于进入细胞或组织。DNA：比较稳定，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降解减少到最低限度，固定剂的种类、浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。固定剂：多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouin’s固定剂、Carnoy’s液优缺点：沉淀性固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液能增加核酸探针的穿透性，但不能最大限度地保存RNA，且对组织结构有损伤。戊二醛：能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交叉连接，从而影响了核酸探针的穿透性。多聚甲醛：仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。多聚甲醛——mRNA的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结果。病理学活检取材——福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号。石蜡包埋切片——由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片，同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。冷冻切片——应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得满意效果。2玻片和组织切片的处理（1）玻片的处理热肥皂刷洗自来水清洗清洁液中浸泡24h清水洗净烘干95%酒精中浸泡24h蒸馏水冲洗烘干烘箱温度＞150℃过夜以去除RNA酶盖玻片硅化处理锡箔纸包裹无尘存放（2）增强组织的通透性和核酸探针的穿透性根据应用固定剂种类、组织种类、切片厚度和核酸探针长度而定。常用方法：稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂TritonX-100、酒精或某些消化酶等。优点:通过去蛋白作用增强组织通透性和探针的穿透性,提高杂交信号.缺点:减低RNA的保存,影响组织结构形态.因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。（3）减低背景染色预杂交（Prehybridization）:是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。杂交后洗涤:采用低浓度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗涤一次，去除残留的和内源性的RNA酶，减低背景染色。（4）防止RNA酶的污染①在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。②所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤——消除RNA酶,亦可用消毒锅。③要破坏RNA酶，最低温度必须在150℃左右。④消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出时空气污染。⑤杂交前及杂交时所用的溶液需经高压消毒处理。3杂交（Hybridisation）杂交:核酸探针进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。杂交方式:是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。加盖片的目的防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发;硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑,无气泡,不会影响组织切片与杂交液的接触;盖玻片自身重量能与杂交液吸附达到覆盖和防蒸发的作用。杂交注意环节（1）探针的浓度原则:探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。最佳原则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度为目的。杂交液的量要适当:以10～20μl/每张切片为宜。杂交液过多浪费，且液量过多常易致盖玻片滑动脱落,过量的杂交液含核酸探针浓度过高，易导致高背景染色等后果。（2）探针的长度最佳长度应在50～100个碱基之间。探针短---易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。500个碱基的探针---杂交时间约需20h左右。200～500个碱基的探针---可应用.超过500个碱基的探针---在杂交前最好用碱或水解酶进行水解，使其变成短的片段，达到实验所需求的碱基数。（3）杂交的温度和时间杂交温度：DNA或RNA需加热或变性、解链后才能进行杂交。原位杂交中，DNA、RNA探针需要的Tm分别是90℃、95℃，这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片上是不可能的。因此，在杂交液中加入盐和甲酰胺，减低Tm。根据探针的种类不同，温度略有差异。杂交时间：16-20h或孵育过夜甲酰胺：在杂交液中占50%左右；调节杂交反应温度，利于保持组织形态结构；防止低温时非同源性片段结合；但具有破坏氢键的不稳定作用。硫酸葡聚糖：在核酸杂交液中硫酸葡聚糖占10%左右；是一种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合作用，因而能大大增加杂交液的粘稠度；促进杂交率，特别是对双链核酸探针。甲酰胺和硫酸葡聚糖：（4）杂交严格度（Hybridizationstringency）杂交严格度：表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。错配对杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。所以，杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低，反应亦然。低严格度：杂交及冲洗条件在Tm35–40℃之间，高盐或低甲酰胺浓度。大约有70%～90%的同源性核苷酸序列被结合，可导致非特异性杂交信号的产生。中严格度：Tm20-30℃的范围。高严格度：为Tm10-15℃，低盐和高甲酰胺浓度。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。4杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。目的：通过杂交后的洗涤将组织切片中非碱基配对除去，有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。洗涤的条件：如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低，而温度则由低到高。注意事项：漂洗过程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。放射性标记探针杂交后漂洗过程中可用底片曝光的方法测背景染色作为改善漂洗程序的指针。5显示Visualization又称检测系统Detectionsystem根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。放射自显影：图象分析仪检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织：酶检测系统显色显微分光光度计或图像分析仪检测。6对照实验和ISHH结果的判断①Northern和Southern印迹杂交法。②可用结合的免疫组织化学和ISHH法从蛋白质（或多肽）水平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相应mRNA共存于同一细胞中。③预先将切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技术证明丢失的是DNA或RNA。事先与特异性的cRNA或cDNA进行杂交。再进行ISHH，其结果应为阴性。由于同一RNA探针和组织内mRNA序列顺序是相同的，应用其进行ISHH，结果应为阴性。④检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针的情况下进行。多因素都将影响ISHH的实验结果。（二）核酸探针1核酸探针的种类2探针的标记与应用1核酸探针的种类（1）按标记方式分类直接法和间接法：１）直接标记探针应用藕联异硫氰酸荧光素（FITC）或罗丹明Rhodamine等荧光物质的dNTP或NTP直接标记探针，杂交洗涤后即可在显微镜下检测。２）间接标记探针采用生物素或地高辛等半抗原分子作为分子标记探针，杂交洗涤后分别用抗生物素抗体和抗地高辛抗体作为配体进行检测，配体上分别连有不同的荧光物质，在荧光显微镜下观察分析。两种方法的比较：（1）直接标记的DNA探针杂交后经过简单洗涤就可显示杂交信号，简单方便，而间接标记的探针杂交后需通过繁琐的检测步骤；（2）间接标记的探针可进行多步骤信号放大，但其受配基亲和力的影响。而直接标记的信号放大一般受到限制，目前多用Dupon公司的TSA系统进行直接标记信号的放大。（3）对于多色FISH，往往选择直接标记法标记探针。（2）按核酸性质分类①DNA探针②cDNA探针③RNA探针④寡核苷酸探针（3）按染色体上位置分类：①重复序列探针②涂染探针③基因探针及其它2探针的标记与应用切口平移法（Nicktranslation）随机引物法(RandomPrimer)末端标记法PCR标记法体外转录标记法不同模板需不同标记方法生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用1光敏生物素标记cRNA探针的应用2酶促生物素标记cRNA探针的应用1光敏生物素标记cRNA探针的应用光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA或RNA分子上，属于化学修饰法，此方法简单；成本低；适用于大量制备（50ug）。光敏生物素试剂种类：光生物素（乙酸盐）补骨脂素生物素。生物素-聚乙二醇-当归素（BPA）：在长波UV下它可与DNA碱基共价键结合。BPA反应物与DNA结合比光敏生物素更特异，在可见光下它不与核酸反应，这个特异性可使BPA只标记粗制细胞裂解物中的核酸，而不标记蛋白、多糖和其他细胞大分子。光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序如下：１石蜡切片脱蜡入水后，PBS洗；冰冻切片直接入PBS洗。２0.1mol/L甘氨酸PBS洗5min。３0.4%TrixtionX-100PBS洗15min。４1ug/ml蛋白酶K，37℃保温30min。５4%多聚甲醛PBS固定。６0.1mol/LPBS洗2×3min。７0.25%乙酸酐10min。８2×SSC洗10min。９取10ul含相应探针的杂交液滴于标本上，如果是cDNA探针，则用前将探针于95℃水浴中保温10min，马上冰浴冷却，然后再用。10盖上硅化盖玻片或蜡膜，43℃湿盒保温12—16h。114×SSC洗脱盖片，并在同一液中，37℃漂洗10-30min。122×SSC（含20ug/mlRNaesA，适于RNA探针）37℃洗30min。131×SSC，0.1×SSC，37℃各漂洗10-30min。140.05mol/LPBS洗4×5min。153%BSA（0.4%TritonX-100PBS配）37℃保温30min。16碱性磷酸酶室温1~3h。170.05mol/LPBS洗