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1第1课时基因工程的发展历程和工具学习导航明目标、知重点难点○1了解基因工程的概念、诞生及发展。○2掌握限制酶及DNA连接酶的作用。（重、难点）○3理解载体需具备的条件。（难点）一、阅读教材P7～9第三段完成基因工程发展历程的相关问题1．理论与技术基础(1)沃森和克里克建立了DNA分子双螺旋结构模型。(2)科恩伯格及其合作者首次在大肠杆菌中发现了DNA聚合酶。(3)梅塞尔森和斯塔尔发现了DNA半保留复制的机理。(4)克里克提出了描述遗传信息流向的中心法则。(5)尼伦伯格和霍拉纳等破译了全部64种遗传密码。(6)罗思和赫林斯基发现细菌拟核外的质粒具有自我复制能力，并能在细菌细胞之间转移。(7)在大肠杆菌细胞中发现了DNA连接酶。(8)特明和巴尔的摩发现了逆转录酶，证明遗传信息也可以从RNA反向传递到DNA。(9)史密斯等人分离到第一种特异性很强的限制性核酸内切酶。2．基因工程(1)概念：在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，并使重组基因在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术，又称为DNA重组技术。(2)诞生事件：1973年，斯坦福大学科学家科恩等将两种不同来源的DNA分子进行体外重组，并首次实现了重组DNA分子在大肠杆菌中的表达。(3)发展阶段：1973～1976年为开始期；1977年生产出生长抑制素释放因子，到1981年为发展期；1983年通过农杆菌转化法培育出世界上首例转基因植物——转基因烟草，以2后为迅猛发展期。二、阅读教材P9第四段～P12分析基因工程的工具——酶与载体1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(1)能识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。(2)在合适的反应条件下使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)切割出黏性或平口末端。2．“分子针线”——DNA连接酶连接两个DNA片段形成两个磷酸二酯键成为一个重组DNA。3．“分子搬运工”——目的基因进入受体细胞的载体(1)常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物以及一些动植物病毒等。(2)质粒DNA分子常用作载体，其至少包括：①含有复制原点且能保证在受体细胞中进行独立复制的复制区。②独特的标记基因，用于鉴定和选择重组DNA分子。③目的基因(外源基因)插入位点，便于目的基因的插入。判一判(1)通过基因工程改造成的生物为新物种。(×)(2)限制性核酸内切酶和DNA解旋酶的作用部位相同。(×)(3)DNA连接酶起作用时不需要模板。(√)(4)限制性核酸内切酶能识别特定的核苷酸序列。(√)(5)重组DNA分子中的标记基因的作用是用于筛选获得含重组DNA分子的受体细胞。(√)连一连3基因工程中的工具酶——限制性核酸内切酶和DNA连接酶要实现基因工程中的“剪切”和“拼接”过程必须有操作工具。结合教材P9第四段～P12边做边学内容完成以下探究。探究1完善下图并回答下列问题，理解限制性核酸内切酶的作用(1)作用特点：每种限制性核酸内切酶能识别特定的脱氧核苷酸序列，且在特定位点上切割DNA分子。该序列也称为识别序列，一般具有回文序列。(2)切割结果：按照切割的方式不同，可分为错位切和平切，大部分限制性核酸内切酶在切开DNA双链时为错位切。错位切是在DNA分子两条链的不同部位进行切割，切割后两个末端均留下一段游离的单链，这种单链被称为黏性末端。平切是在DNA分子两条链上相同的部位进行切割，切割后形成一个平口末端。(3)由上图推出：限制性核酸内切酶的作用部位是图中[4](图中数字表示)连接相邻脱氧核苷酸的键(磷酸二酯键)，而不是碱基间的[1]氢键。探究2观察下图并回答下列问题，DNA连接酶的连接作用4(1)从上图来看DNA连接酶的作用是把DNA分子“梯子”的扶手断口处连接起来。结果是形成一条重组DNA分子。(2)从图中DNA连接酶的作用部位分析，它与限制性核酸内切酶的作用部位相同(“相同”“不同”或“无法确定”)。探究3观察下图，归纳DNA连接酶与限制性核酸内切酶的关系(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。(2)限制酶和DNA连接酶的作用结果相反(相同、相反)。(3)限制酶能识别特定的脱氧核苷酸序列，在特定位点上切割DNA分子；DNA连接酶无特定位置。(1)从下图中的①和②中选出限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和DNA解旋酶四种酶的作用部位。提示：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和DNA聚合酶作用于①部位；DNA解旋酶作用于②部位。(2)上述四种酶中具有识别作用的是哪个？提示：限制性核酸内切酶。1．DNA连接酶与限制性核酸内切酶的比较项目作用应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于基因表达载体的构建52.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键不同点模板不需要模板需要DNA的一条链为模板作用对象游离的DNA片段单个的脱氧核苷酸作用结果形成完整的DNA分子形成DNA的一条链用途基因工程DNA复制突破1限制酶1．限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。如图所示为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的辨别序列，箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列应该为()A．BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互补序列为—AATT—B．BamHⅠ和HindⅢ；末端互补序列为—GATC—C．EcoRⅠ和HindⅢ；末端互补序列为—AATT—D．BamHⅠ和BglⅡ；末端互补序列为—GATC—解析：选D。A项中BamHⅠ切割出的末端序列为—GATC—，EcoRⅠ切割出的末端序列为—AATT—，两者不能互补黏合；B项中HindⅢ切割出的末端序列为—AGCT—，与BamHⅠ切割出的末端序列不能互补黏合；同理可推出C项所示两种限制酶所切割出来的末端也不能互补黏合，只有D项所示两种限制酶所切割出来的末端才能互补黏合。限制酶的识别序列和切割末端的判断,6(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以AT为轴，两侧碱基互补对称。,(2)判断黏性末端或平口末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是：将黏性末端或平口末端之一旋转180°后，看它们是否是完全相同的结构。)突破2DNA连接酶2．下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是()A．将单个核苷酸加到某DNA片段末端，可形成磷酸二酯键B．连接两条DNA链上碱基之间的氢键C．将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平口末端之间进行连接解析：选C。DNA连接酶的功能是催化两个双链DNA分子片段之间的磷酸二酯键的形成，从而将两个DNA分子连接起来；有的DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平口末端。有关DNA的三种酶的区别(1)DNA酶即DNA水解酶，是将DNA水解的酶；(2)DNA聚合酶是在DNA复制过程中，催化形成新DNA分子的酶，是将单个游离的脱氧核苷酸加到DNA片段上，需要模板；(3)DNA连接酶是将两个DNA片段的两个缺口同时连接，不需要模板，两者作用的化学键相同，都是磷酸二酯键。基因工程中的“分子搬运工”——载体[学生用书P4]完成下图，结合教材P12第一～三段内容回答相关问题：7(1)各组成部分的功能①复制区：含有复制原点，保证在受体细胞中进行独立复制。②独特的标记基因：最常见的是抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因或某些生化表型等标志基因。用于鉴定和选择重组DNA分子。③目的基因插入位点：是某种限制性核酸内切酶的切割位点，便于目的基因的插入。通常一个质粒上会含有多种限制性核酸内切酶的切割位点。(2)用限制性核酸内切酶切割质粒和外源DNA分子，并通过DNA连接酶的连接成为外源基因表达载体。(1)怎样选用限制酶？提示：限制酶识别的切割位点，不能在载体的复制起始点、标记基因等载体必需的基因片段，切点所处位置必须在载体需要的基因片段之外，避免载体因目的基因的插入而失活或影响鉴定和筛选。(2)作为载体必须具有一个至多个限制性核酸内切酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，为什么？提示：因为某种限制性核酸内切酶只能识别单一切点，若载体上有一个以上的酶切点，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有某种限制性核酸内切酶的一个切点，则酶切后既能把环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。基因工程中的载体种类常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等8质粒①质粒是最早应用的载体；②结构：细菌细胞中的很小的环状DNA分子；③特性：质粒的存在对宿主细胞无影响；④重组质粒的形成：用同一种限制性核酸内切酶切割质粒和外源DNA分子，并通过DNA连接酶的连接，就能将质粒和外源DNA分子组成一个重组质粒(重组DNA分子)作用将外源基因送入受体细胞条件①能在宿主细胞内复制并稳定地保存；②具有一个至多个限制性核酸内切酶切点；③具有某些标记基因突破1质粒载体1．下列有关质粒的叙述，正确的是()A．细胞膜上的载体和基因工程中的载体的化学本质相同B．质粒是基因工程中唯一的运载体C．载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器解析：选C。细胞膜上载体的化学本质是蛋白质，而基因工程中载体的化学本质是小型环状DNA分子，故A错误；质粒是基因工程中常用的运载体，但不是唯一的，B错误；运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接，C正确；质粒不属于细胞器，D错误。细胞膜上的载体与基因工程中的载体的区别(1)化学本质不同：细胞膜上的载体的化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、也可能是生物，如噬菌体和动、植物病毒等。(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。突破2载体的标志基因2．在基因工程中，可依据受体细胞的类型及其生理特性来选择合适的载体，既能高效9地携带目的基因进入受体细胞，又能方便地进行检测。已知有以下几类含有不同标记基因的质粒，不可作为侵入大肠杆菌的载体的是(已知青霉素可杀死大肠杆菌，四环素不能杀死大肠杆菌)()解析：选B。A质粒携带目的基因是否进入大肠杆菌，可用含有青霉素的培养基培养大肠杆菌，如果大肠杆菌不死亡，说明这些大肠杆菌已含有了A质粒上的标记基因表达出的性状，进一步说明目的基因已被携带进入大肠杆菌细胞内，故A项不符合题意；B质粒上的抗四环素标记基因对大肠杆菌无影响，所以不能用于对目的基因是否进入大肠杆菌的检测，即该载体不可作为侵入大肠杆菌的载体，B项符合题意；C和D质粒上的标记基因均可明显指示目的基因是否进入大肠杆菌细胞内，故C、D项均不符合题意。载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：核心知识小结10[网络构建][关键语句]1.限制性核酸内切酶的作用特点是识别双链DNA分子上特定的核苷酸．．．．．．序列，并在特定位点．．．．上切割。2.限制酶和DNA连接酶的作用部位都是两个脱氧核苷酸间的磷酸二酯键．．．．．，二者作用结果相反；DNA．．．连接．．酶没有识别能力。3.在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒．．．．．等。[随堂检测]知识点一基