LFY类基因在茎端分生组织形成及其活动中的作用

北京大学政学者论文集（2001年）LFY类基因在茎端分子组织形成及其活动中的作用378LFY类基因在茎端分生组织形成及其活动中的作用ExpressionPatternofLFY-likeGeneanditsFunctioninShootApicalMeristemActivity98级生命科学学院细胞生物与遗传学系刘曼摘要LFY类基因在植物形态建成过程中具有重要作用，根据其突变体的特征，曾一度被认为是在花分生组织和花序分生组织中特异表达的“分生组织特征决定基因”，控制花序分生组织向花分生组织的转变。但随着研究的深入，人们发现其在营养分生组织甚至胚胎发生过程中都有所表达。本实验试图通过启动子活动特点研究、mRNA水平上原位杂交分析等各种方法，对其功能进行深入地探讨，以期全面地认识该类基因在植物发育中的作用。AbstractLFY-likegenesplayimportantroleinplantdevelopment,whentheywerefirstisolatedfrommutantsofAntirrhinumandArabidopsis,theywerethoughttobe“SAM-specific-determinating-genes”,regulatingthetransitionfrominflorescencetoflowermeristem.However,furtherresearchrevealedthatLFY-likegenes’activitycanbefoundinembryogenesis,shootapicesandaxillarybudsatdifferentstagesaswellasinflowerprimordial.WecharacterizedLFYpromoter’sactivityandinvestigatedLFYmRNAexpressionwithWhole-mountinsituHybridization,北京大学政学者论文集（2001年）LFY类基因在茎端分子组织形成及其活动中的作用379inordertomaketheirfunctionclearer.引言植物形态建成有与动物形态建成完全不同的特点：其完成生活周期所需的地上部分基本器官类型都是由茎端分生组织（shootapicalmeristem,SAM）的活动而逐步形成的。因此，茎端分生组织在植物形态建成中的重要性是不言而喻的。但长期以来，虽然人们始终在努力，而且近十年来出现了分离得到茎端分生组织活动相关基因等重大的突破[1]，可目前在茎端分生组织的形成变化及其终结方式等基本问题方面却仍然没有得到合乎逻辑的解释。根据突变体研究的早期结果，人们形成了目前占主导地位的观点，即茎端分生组织在“胚胎发生”过程中形成，随后在“胚后发生”的过程中，被一些“分生组织特征决定基因”控制，逐步由“营养分生组织”改变为“花序分生组织”和“花分生组织”[2]。但随着研究的深入，人们逐渐发现，一些过去被认为是在“花分生组织”和“花序分生组织”中特异表达的“分生组织特征决定基因”，大部分都不用程度地在“营养分生组织”甚至“胚胎发生”过程中表达[3-7]。这些现象是现有的假说所无法解释的。显然，这些新的发现对现有的观点提出了不可回避的挑战。只有通过对这些基因表达特征及其功能的深入研究，我们才有可能真正从分子水平上逐步解释茎端分生组织形成、活动及其终结的分子机理并从中逐步揭示茎端分生组织在植物形态建成中所扮演的角色。LFY类基因正是上述基因中的一种。它的突变导致植物表型发生一系列的变化。在野生型植物体中应发育成花的部位，在lfy突变体中则发育出花序，或是仅由萼片和花瓣组成的异常花。而且LFY和APETALA1或APETALA2的双重突变体会导致植物的花完全丧失野生型花所具有的缩短节间、顶端有限生长等特点。根据以上种种现象，当LFY类基因从金鱼草和拟南芥的有关突变体中分离出来时，被认为其在植物发育中控制茎端分生组织从花序分生组织转变为花分生组织[2，8]。但随着该基因的同源序列从其他植物中被陆续分离，人们发现在烟草、凤仙花、豌豆、矮牵牛、水稻、松树等植物中，LFY类基因的表达并不局限于花分生组织，而是广泛地存在于不同发育阶段的茎端分生组织[3-6，9，10]。更重要的是，后来的研究表明，即使在拟南芥中，LFY基因实际上在其早期的发育阶段，即在花序分生组织形成之前，已经在茎端分生组织中表达[11]。同时，转基因实验表明，LFY基因表达量越大，植物开花越早[12，13]。因此，对该基因的功能又有了一种新的认识，即它不仅决定花序分生组织转变为花分生组织，而且还影响开花的早晚。白书农教授等在进行另一种拟南芥突变体emf的研究中，曾注意到LFY基因在植物早期发育阶段表达中的特点，并曾利用LFY::GUS转基因植物为材料，对其在植株“营养生长”阶段的表达特点进行过系统的研究[白书农等，未发表资料，1998]。发现LFY基因的启动子不仅在种子萌发后不同阶段的茎端分生组织和幼小的器官原基中表达，而且在早期胚胎发生过程中也有表达。最为引人注目的是，LFY基因启动子的活动与由根外植体再生植株过程中茎端分生组织的形成及其活动存在直接的相关。据此白书农教授等提出，LFY基因的表达很可能与茎端分生组织的形成及其活动有关，而它表达量的增长水平和开花相关联。但是，有研究表明，以GUS等报告基因所显示的启动子活动模式可能并不北京大学政学者论文集（2001年）LFY类基因在茎端分子组织形成及其活动中的作用380一定反映该启动子对其原有基因表达的时空调节模式。因为基因的表达不单需要启动子的活动，还和一些其他因子，例如内含子等有关。因此，要真正了解LFY基因在分生组织形成与活动过程中的表达特点，还应有对其转录产物即mRNA进行原位检测的证据。本课题即是在本实验室过去工作的基础上，试图从正常植株与组培过程再生植株中LFY启动子活动方式的检测和LFY基因转录产物的直接检测两个方面，对LFY类基因早期表达特点及其可能的功能等关键问题进行进一步地探讨。本课题研究中主要涉及两种基因表达的检测技术。当研究LFY启动子活动方式时，我们采用报告基因的表达分析方法。报告基因通常编码一个在离体条件下易于检测的酶，或者编码可以在活体条件下进行组织化学定位的蛋白，这样就可以提供基因表达定量的和定性的信息。gusA基因是从大肠杆菌（Escherichiacoli）中分离出来的，并且目前有一些基因盒可以允许在gusA基因的附近插入启动子区，产生转录融合基因或翻译融合基因。我们实验所用的Plfy::GUS拟南芥和Plfy::GUS烟草、Pnfl::GUS烟草即是在gusA基因前插入LFY或NFL基因的启动子（Plfy或Pnfl），当Plfy或Pnfl活动时，带动gusA表达，利用一个简单的组织化学检测就可以精确地分析gusA融合基因的时空表达模式。用5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸（X-gluc）作为底物可以精确地进行GUS活性的定位，这一反应分两步进行：首先是切割葡糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。用GUS进行这类实验有如下优点：（1）在大多数植物组织中GUS活性的本底低；（2）反应产物不扩散，在表达基因的植物细胞内积累；（3）通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。当然，也存在一些缺点：（1）组织化学染色后植物失去继续培养的可能，这样不能跟踪检测同一株植物不同时期的基因活动情况；（2）由于酶和产物非常稳定，因而不能真实的反映出GUS替代的那个蛋白在稳定状态下的丰度；（3）人们发现在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应中间产物渗漏的现象，但是，这可以通过在底物溶液中加入氧化剂高铁氰化钾或亚铁氰化钾或者二者都加（终浓度为5mmol/L），来使这种渗漏减至最少（Stomp1990;Masarenhas和Hamilton1992）；（4）同所有的组织化学方法一样，其检测结果不是定量的。而且，最致命的缺点是，启动子的分析不一定总能反映基因的真实活动情况（如前文所述），这是在运用报告基因方法进行基因表达特征分析时必须注意的一个问题。当检测LFY基因的转录产物时，我们用到了原位杂交（insituHybridization,简称ISH）技术。该技术最早是由Gall和Pardue(1969)及John等(1969)独立发明的。其基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则（A-T,C-G）,将有放射性或非放射性标记的外源核酸(探针：Probe)与染色体上经过变性后的单链DNA互补配对,结合成专一的核酸杂交分子,再经一定的检测手段,将待测核酸在染色体上的位置显示出来。我们采用的mRNA水平的原位杂交技术，是将含有目的基因cDNA的质粒分别用限制性内切酶从目的片断的两端单切，使质粒线性化。然后从两端用不同的转录酶按照A-U,C-G的互补配对原则合成一段RNA片断，其中UTP上标记地高辛，这标记上的RNA片断即为探针。当目的基因表达时，mRNA能和反义探针特异性结合，在底物的作用下显色。而正义探针为负对照。由于RNA原位杂交技术能够精确确定基因表达的时空分布，而植物基因的时空表达研究是探讨植物生长发育机制的重要手段，所以在以研究植物发育机制为主的本实验室，原位杂交成为北京大学政学者论文集（2001年）LFY类基因在茎端分子组织形成及其活动中的作用381一项主要的并十分关键的技术。目前植物研究中，原位杂交得到了越来越广泛的应用，主要有3种方法:一是常规组织切片RNA原位杂交，广泛适用于各种组织;二是大量细胞的整体RNA原位杂交,已应用于花粉管和藻类合子;三是微量细胞的整体RNA原位杂交,用于分离胚囊。我所使用的整体原位杂交技术，是一种较新的组织RNA原位杂交方法。该方法的实验材料是具有完整形态结构的植物器官或其组合，如花、花序等。该技术能够直接从整体结构上观察到基因表达的空间特征，具有易操作、周期短等特点，并避免了一般在切片上原位杂交所需的三维重构步骤。材料和方法1．实验材料1.1植物材料野生型拟南芥种子（Columbia）Plfy::GUS转基因拟南芥种子（由DetlefWeigel提供）野生型烟草种子（Nicotianatabacunvar.Wisconsin38）Plfy::GUS转基因烟草种子（由本实验室毕业博士生刘复权构建、提供）1.2菌种和质粒大肠杆菌DH5ɑ质粒：Pnfl::GFP(KanR)Plfy::antiLFY(KanR)PDW124-LFY(AmpR)以上质粒均由本实验室已毕业博士生刘复权构建，本实验室保存。1.3分子生物学和生化试剂各种限制性内切酶购自TaKaRa公司，PCR试剂购自鼎国生物公司，原位杂交地高辛标记RNA探针试剂盒及杂交液（DIGeasyHyb）购自Roche生物公司，各种激素和抗生素以及x-Gluc购自北京经科生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯。1.4PCR引物以GFP基因为模板的PCR引物由本人设计，上海生工生物工程公司合成。5’GFP(21bp):5’-GGTGAAGGTGATGCAACATAC-3’3’GFP(18bp):5’-GAAAGGGCAGATTGTGTG-3’1.5x-Gluc染色液(1mL)N、N—二甲基甲酰胺50uLx-Gluc0.5mg100mM磷酸缓冲液pH7.0980uL5mM铁氰化钾10uL5mM亚铁氰化钾10uLTritonx-1001uL北京大学政学者论文集（2001年）LFY类基因在茎端分子组织形成及其活动中的作用3821.6植物叶绿素透明液乙醇：乙酸=9：11.7培养基1.7.1拟南芥、烟草组织培养基MS(含3%的蔗糖和0.75%的琼脂，调pH=5.8)愈伤组织诱导培养基（Callus-InducingMedium,CIM）:B5+0.5mg/L2,4-D+0.05mg/LKIN(含2%的蔗糖和0.75%的琼脂，调pH=5.5)生芽培养基（Shoot-InducingMedium