抗生素类药物的分析(好)剖析

第十四章抗生素类药物的分析第一节概述抗生素的定义抗生素是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物，对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用。1.生物合成（发酵）2.化学合成或半合成抗生素的来源抗生素类药物的特点3、稳定性差1、化学纯度较低2、活性成分易发生变异抗生素质量的复杂性产品稳定性差分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用发酵过程不易控制易受污染生产工艺复杂发酵液中杂质无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、毒性物质增加异常毒性、细菌内毒素、热原、降压物质、无菌[检查]含量测定方法（一）生物学方法测定抗生素抑菌或杀菌的能力优点1、与临床效果一致2、灵敏度高3、干扰物质少缺点1、操作繁琐2、培养时间长3、测定误差大（二）化学及物理化学方法以理化方法测定主药含量优点1.准确度高2.简单、快速1.不一定代表生物效价缺点2.易受杂质干扰分类（按结构）：β–内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类林可霉素类、其他抗生素类第二节β–内酰胺类抗生素青霉素类头孢菌素类青霉素（青霉素G、苄青霉素）氨苄西林（氨苄青霉素）阿莫西林（羟氨苄青霉素）普鲁卡因青霉素头孢氨苄头孢羟氨苄酸性一、结构与性质Na与碱金属(Na+、K+)成盐（一）羧基易溶于水与有机碱(普鲁卡因)成盐难溶于水普鲁卡因青霉素（二）手性C头孢菌素类C6C7青霉素类C3C5C6旋光性﹡﹡﹡﹡﹡（三）共轭体系头孢菌素类母核有共轭体系青霉素类母核无明显UV多数有苯环取代基UV（四）β–内酰胺环的不稳定性水溶液不稳定干燥纯净稳定不稳定性因素四元环张力大(β–内酰胺环)酰胺键易水解（一）呈色反应1.羟肟酸铁反应β-内酰胺类NaOH呈色Fe3+/3H+二、鉴别H+Fe3+/3（红、棕、褐）.①双缩脲反应β-内酰胺类（开环分解）似肽键2、肽键特征反应②.茚三酮反应△α-氨基蓝紫色3.与重氮苯磺酸反应（偶合）酚羟基头孢哌酮（偶合）（二）沉淀反应1.钠盐反应：遇酸→↓在过量HCl或有机溶剂中溶解2.有机胺盐反应（1）重氮化-偶合反应重氮化-偶合反应芳伯氨基普鲁卡因普鲁卡因青霉素K+、Na+反应（三）焰色→鲜黄色+醋酸氧铀锌→↓黄Na+焰色→紫色+0.1%四苯硼钠+HAc→↓白K+光谱法（四）1、UV法样品、分解产物Cu2+头孢氨苄λmax=262nm青霉素V钠A280nm/A264nm=1.30～1.50Cu2+pH3.8△氯唑青霉素3410.682双氯青霉素3420.653苯唑青霉素3391.328(nm)2、（五）IR法β-内酰胺环仲酰胺基色谱法（六）1、TLC法对照品对照法2、HPLC法三、特殊杂质的检查•（一）高分子杂质检查分子排阻色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法•（二）吸光度检查汞量法（二）1.原理（水解）青霉素类ChP四、含量测定2.方法醋酸盐缓冲液pH4.6滴定水解pH4.6滴定样品以未经水解的样品作空白测定例青霉素钠含量测定取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置15分钟，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水20ml，摇匀，照电位滴定法(附录ⅦA),用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在35～40℃，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)缓慢滴定，（控制滴定过程约为15分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于7.128mg的总青霉素(按C16H17N2NaO4S计算)。另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，终点判断方法同上.每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于7.128mg的降解物（按C16H17N2NaO4S计算）。总青霉素的百分含量与降解物的百分含量之差值即为青霉素的含量。3、讨论（1）以第二次滴定突跃为终点电位法指示终点（2）反应摩尔比1:1（3）空白试验消除已降解产物干扰（4）优点不需标准品4、计算精密称取含水量为0.5%的青霉素钠0.0502g，按药典方法测定总青霉素含量时，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)6.97ml。另精密称取上述样品0.5013g，按药典方法测定降解物含量时，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)1.33ml。以干燥品计算，求样品中青霉素的含量。例青霉素钠含量测定HPLC法（二）ChP头孢菌素类内标法＋校正因子外标法特点快速、高效、灵敏专属性强、重现性好一法多用（鉴别、检查、含测）哌拉西宁原料药含量测定色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇–0.2mol/L磷酸二氢钠溶液–10％氢氧化四乙基铵溶液–水（400︰50︰3︰547）用磷酸调节pH值至5.5为流动相。检测波长为254nm。第三节氨基糖苷类抗生素链霉素庆大霉素阿米卡星新霉素卡那霉素妥布霉素链霉素链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺苷元糖链霉双糖胺链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺庆大霉素糖苷元绛红糖胺+2-脱氧链霉胺+加洛糖胺糖绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3庆大霉素C2R=R2=HR1=CH3庆大霉素C1aR、R1、R2=H庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H庆大霉素C2bR=R1=HR2=CH3绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺一、结构与性质多与硫酸成盐链霉素3个庆大霉素5个碱性中心碱性水溶性溶解性（一）稳定性（三）二糖胺结构，PH4～7稳定酸性：链霉胍＋链霉双糖胺N-甲基-L-葡萄糖胺碱性：链霉胍＋链霉双糖胺麦芽酚（专属）庆大霉素pH2～12（二）旋光性UV（四）链霉素在230nm处有吸收，庆大霉素、奈替米星无二、鉴别茚三酮反应（一）△羟基胺结构链霉胍特有反应（或α-萘酚）8-羟基喹啉坂口反应（二）α-萘酚麦芽酚反应（三）链霉糖特有反应H+分子重排紫红麦芽酚N-甲基葡萄糖胺反应（四）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色（Elson-Morgan反应）（五）硫酸盐反应H+TLC法（六）CHP庆大霉素及其制剂三、检查链霉素杂质（一）链霉素B（甘露糖链霉素）2.方法TLC中的对照品法（CHP、BP）1.来源反应中间体操作方法：供试品溶液：0.25mg－－10mg/ml甲醇液对照溶液：甘露糖36mg---72ug/ml(1mg甘露糖相当于４.13mg的链霉素Ｂ）薄层板：硅胶Ｇ展开剂：甲苯－醋酸－甲醇（５０：２５：２５）显色剂：０.2%1,3-萘二酚乙醇溶液与20%硫酸液等体积混合。四、含量测定链霉素、庆大霉素微生物检定法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。第四节四环素类抗生素ABCD123456789101112四环素（TC）tetracycline金霉素(CTC)chlortetracycline氯四环素土霉素(OTC)oxytetracycline氧四环素多西环素(DOTC)doxycycline脱氧土霉素美他环素（METC）metacycline结构特点Yourcompanyslogan四并苯或萘并萘衍生物1、酸碱性与溶解度（两性化合物、具引湿性）C4：二甲氨基[－N(CH3)2]－－－弱碱性C10：酚羟基(-OH);共轭系统－－－弱酸性临床多为盐酸盐。盐酸盐易溶于水，溶于酸、碱溶液，不溶于有机溶剂。（二）性质PH4.5-7.2,难溶于水PH8or4,溶解度增加游离碱2、旋光性具有不对称碳原子，有旋光性，可定性、定量。3、紫外、荧光性质共轭双键系统－－UV降解产物－－FLA四环素降解后呈黄色荧光，区别于其他抗生素4、不稳定性（1）差向异构化性质（四环素、金霉素）四环素在PH2.0-6.0发生，C4构型改变。抗菌能力减弱或消失。OOHCONH2(CH3)2NOHHOOHCONH2N(CH3)2HOHAApH2.0~6.0土霉素、多西环素，C5羟基和C4二甲氨形成氢键，结构稳定。（2）降解性质（四环素、金霉素）酸性降解：PH2，C环脱水，生成脱水四环素。ROHCH3OHOOHHRCH3OHOOHRCH3OHOHOH2ODDDCBBCBC脱水四环素类A脱水金霉素435nmA脱水四环素445nm淡黄→黑（3）碱性降解：碱性溶液中，-OH作用，C环开环，形成无活性内酯，生成异四环抗生素。ROHCH3OHR'''OOHOOHCONH2NHOHCH3CH3CH3CH3ROHR'''OOOHCONH2NHOHOCH3O异四环素与金属离子生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+与金属离子络合（六）二、鉴别试验H2SO4反应（一）FeCl3反应（二）荧光法（三）UV绿色荧光H+UVTLC法（四）正相分配薄层色谱高效液相色谱法CHP（五）EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象三、检查·4-差向四环素（ETC）·脱水四环素（ATC）·差向脱水四环素（EATC）·盐酸金霉素（CTC）有关物质（一）HPLC法（2010版）标准品对照法盐酸四环素吸收度（二）杂质吸收度（2010版A530）四、含量测定ChP、USPHPLC法（外标法）系统适用性试验1.防护柱2.预试溶液4-差向脱水四环素四环素3.RSD≤2.0%JP比色法（标准曲线法）标△样△原理1.熟悉抗生素类药物分析的特点及其常规检验项目。了解抗生素类药物的分析现状，熟悉生物学法与物理化学法测定效价的原理及优缺点。2.掌握β－内酰胺类抗生素的结构、性质、鉴别及含量测定。第十一章复习内容3.掌握氨基糖苷类抗生素的结构、性质及鉴别，了解其检查及含量测定4.掌握四环素类抗生素的结构及性质，了解其鉴别、检查及含量测定5.了解抗生素类药物的质量考察方法1．下列哪个药物会发生羟肟酸铁反应A.青霉素B.庆大霉素C.红霉素D.链霉素E.维生素C2．中国药典(2010年版)测定头孢菌素类药物的含量时，多数采用的方法是A.微生物法B.碘量法C.汞量法D.正相高效液相色谱法E.反相高效液相色谱法3．属于-内酰胺类的抗生素药物有A.青霉素B.红霉素C.头孢菌素D.庆大霉素E.四环素4．能和茚三酮发生呈色反应的物质有A．链霉素B．庆大霉素C．土霉素D．氨基酸E．苯巴比妥5.青霉素类药物可用下面哪些方法测定A.三氯化铁比色法B.汞量法C.碘量法D.硫醇汞盐法E.酸性染料比色法6．能发生重氮化一偶合反应的抗生素类药物是A.青霉素B.庆大霉素C.苄星青霉素D.盐酸四环素E.普鲁卡因青霉素7.以下反应可适用的药物A.青霉素B.链霉素C.两者均能D.两者均不能Kober反应羟肟酸铁反应坂口反应N—甲基葡萄糖胺反应在酸性溶液中水解DABBC8：可以鉴别的药物是A.链霉素B.庆大霉素C.两者均可D.两者均不可用Kober反应用坂口反应用麦芽酚反应用三氯化铁反应用茚三酮反应DAADC问题46～50A.茚三酮反应B.麦芽酚反应C.坂口反应D.FeC13反应E.羟肟酸铁反应46．头孢唑林钠47．金霉素48．链霉素49．庆大霉素50．青霉素EDEAABC（）青霉素分子能与碘定量反应，因此可以根据消耗的碘量计算青霉素的含量。×9．四环素在酸性条件下的降解产物是A.差向四环素B.脱水四环素C.异四环素D.去甲四环素E.去甲氧四环素