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汉恒生物‐‐‐腺相关病毒 汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 地址：上海市徐汇区斜土路1175号景泰大厦1503 021‐54121689 实验室：上海市张江高科技园区张江药谷孵化器1号楼314 汉恒生物科技 邮箱：service@hanbio.net汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-AssociatedViralVector，AAV）简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。AAV的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AAV的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AAV病毒整合、复制和装配中其重要作用。图1.AAV基因组结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高：迄今从未发现野生型AAV对人体致病，重组AAV基因组序列上去除了大部分的野生型AAV基因组元件，进一步保证了安全性；2.免疫原性低：AAV2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物‐‐‐腺相关病毒 汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 地址：上海市徐汇区斜土路1175号景泰大厦1503 021‐54121689 实验室：上海市张江高科技园区张江药谷孵化器1号楼314 汉恒生物科技 邮箱：service@hanbio.net是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。AAV无辅助病毒系统（AAVHelper-FreeSystem）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。在AAVHelper-FreeSystem中，生产具有感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（如：E2A，E4等基因）大部分由pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。AAV-293细胞是HEK293细胞经过改良腺相关病毒生产能力而衍生出的亚克隆细胞系。野生型AAV基因组由病毒rep和cap基因（分别编码AAV复制和包装相关的基因）及位于两侧的表达和包装必须的顺式作用元件——反向末端重复序列（InvertedTerminalRepeats，ITRs）组成。在AAVHelper-FreeSystem中，rep和cap基因从病毒载体中被转移到辅助质粒pAAV-RC中，AAVITRs仍位于病毒载体中。在辅助质粒的帮助下，仅需两端的ITR就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒，因此，rep和cap基因的转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的昀大限度。由于不再需要活的辅助病毒，AAVHelper-FreeSystem提供一个更安全，更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。图2.AAVHelper-FreeSystem腺相关病毒系统汉恒生物‐‐‐腺相关病毒 汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 地址：上海市徐汇区斜土路1175号景泰大厦1503 021‐54121689 实验室：上海市张江高科技园区张江药谷孵化器1号楼314 汉恒生物科技 邮箱：service@hanbio.net三、重组腺相关病毒载体不同血清型研究发现AAV具有多种血清型，各种不同血清型的AAV载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前汉恒生物在包装腺相关病毒时有9中不同的AAV血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，见表1。血清型组织亲和性AAV1肌肉，心脏，骨骼肌（包括心肌），神经组织AAV2中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼，AAV3肌肉，肝脏，肺，眼AAV4中枢神经，肌肉，眼，脑AAV5肺，眼，中枢神经，关节滑膜，胰腺AAV6肺，心脏AAV7肌肉，肝脏AAV8肝脏，眼，中枢神经，肌肉AAV9心脏，肌肉，肺（肺泡），肝脏，中枢神经表1.9种不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性CellLineAAV-1AAV-2AAV-3AAV-4AAV-5AAV-6AAV-8AAV-9AAV-DJAAV-DJ/8Huh-7131002.500.1100.705000.2HEK293251002.50.10.150.70.15000.3HeLa310020.16.710.20.16670.2HepG2310016.70.31.750.3ND12500.5Hep1A201000.210.110.204000.191117100110.20.1170.1ND5000CHO100100141.433350101250005COS33100333.351420.55000.3MeWo10100200.36.71010.228571NIH3T3101002.92.90.3100.3ND5000.1A5491410020ND0.5100.50.110000.1HT118020100100.10.3330.50.13330.2Monocytes1111100NDND1251429NDND100NDImmatureDC2500100NDND2222857NDND200NDMatureDC2222100NDND3333333NDND100ND表2.不同血清型AAV感染体外培养细胞比较四、AAV病毒包装(一)AAV-293细胞的冻存汉恒生物‐‐‐腺相关病毒 汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 地址：上海市徐汇区斜土路1175号景泰大厦1503 021‐54121689 实验室：上海市张江高科技园区张江药谷孵化器1号楼314 汉恒生物科技 邮箱：service@hanbio.net随着传代的次数增加，AAV-293细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。1、去掉细胞培养上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL37℃预热的10％DMEM，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ul10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。4、细胞离心，1000rpm/min，5min。去掉上清。5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）重悬细胞，密度为3x106个/ml。6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。（二）AAV-293细胞的传代当细胞生长到汇合率达到80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。1、消化细胞，方法同细胞冻存。2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。3、根据具体情况，将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。（三）AAV-293细胞的复苏当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对昀初冻存的细胞进行复苏。汉恒生物‐‐‐腺相关病毒 汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 地址：上海市徐汇区斜土路1175号景泰大厦1503 021‐54121689 实验室：上海市张江高科技园区张江药谷孵化器1号楼314 汉恒生物科技 邮箱：service@hanbio.net、设置温度为37~42℃的水浴。2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min内使细胞溶液完全溶解。3、将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm/min，5min。4、