免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学

免疫组织化学傅琦博引言酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。免疫组织化学概述免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。免疫组织化学技术的发展免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane等人于60年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger等人于70年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法)和PAP法(过氧化酶抗过氧化酶法)。80年代初期美籍华人Hsu又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法),自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,Streptavidin)与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP法,或称LSAB法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法)。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC法高4～8倍,比PAP法高8～16倍。进入90年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质,并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体)的含量,以达到对定性、定位、定量测定的目的[2]。如黄祥瑞等人(1999)利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE),成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒SindbisVirus(SiN)引起的人兽共患虫媒病毒病,1974年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通过免疫荧光技术首次从新疆分离到SiN病毒。1999年陈振光等利用间接免疫荧光试验检测到福建宁化林区人群、野兔、狐狸、狗存在SiN感染,抗体阳性率分别为12.86%、5.88%、14.29%、6.45%。因而判定福建宁化林区可能存在辛德毕斯热自然疫源地。2抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术(AvidinBiotin2PeroxidaseComplextechnique,简称ABC技术)是Hsu等于1981年创立,其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。该方法简便、节约时间,敏感性、特异性高,背景染色淡。由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力,可用于双重或多重免疫染色。如李月白等采用ABC法研究发现绒毛层滋养细胞、绒毛中轴的基质细胞、毛细血管的内皮细胞、毛细血管腔内的淋巴细胞以及血岛细胞均表现为P物质(SP)受体免疫反应阳性,阳性物质分布于胞质和胞膜上,胞核呈阴性反应。该研究为其对胎盘及胚胎发育的作用提供形态学依据。张雅萍在ABC法基础之上改进,建立了生物素-抗生物素-过氧化物酶复合物(sABC)法,探讨了IL28在甲状腺肿瘤组织中的表达及意义。3葡萄球菌蛋白A(StaphylococalProteinA,SPA或SP)具有免疫特性,发展成为免疫学上一种极为有用的工具。其优点是不受种属特异性的限制,染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等。故在目前各种免疫细胞化学技术中得到广泛的应用。如肖华亮等[9]用此法检测、探讨骨肉瘤MDM2和p53蛋白定位、表达水平及相互关系和其对骨肉瘤转移及预后的影响。应用SPA与胶体金或铁蛋白相结合,可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。自Pomano和Romano(1977)首次报告用蛋白A-胶体金技术(ProteinA2Goldtechnique,PGA技术)标记细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以来,SP法已得到愈来愈广泛的应用,并发展成为一种较为理想的免疫电镜技术。4碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶方法(简称APAAP法)克服了辣根过氧化酶(HRP)的不足。沈岩等用APAAP法结合单克隆抗体(mAb)KL21(广谱抗人细胞角蛋白,德国)比较分析不同肿瘤细胞间同种细胞凝集力、靶器官定植力、细胞增殖和细胞凋亡现象、癌基因及肿瘤相关抗原表达等生物学特征。进一步明确肿瘤细胞相关生物学特性与肿瘤细胞转移能力间的关系。而链霉素亲和素(Streptavidin,SA)具有高度的亲和力,利用生物素结合的二抗与酶标记的SA亲和(LSAB法)是免疫组化中非常有用的方法。沈靖南等采用该法,检测84例骨肉瘤中p2糖蛋白(p2gp)表达,半定量化计量p2gp的着色强度及阳性率,通过多因素相关分析和生存分析,探讨骨肉瘤预后的相关因素和高危因素,研究骨肉瘤多药耐药性的表达与预后,并证实p2gp介导骨肉瘤的MDR现象,明确p2gp表达与肺转移的关系。5凝集素((Phytoagglutin,PHA)作为一种探针研究细胞膜上特定的糖基,具有多价结合能力。直接将标记物标记在凝集素上,再与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合,该法简便,但灵敏性不够高。经研究发现将凝集素直接与切片中的相应糖基结合,可提高敏感性高5～10倍或更多一些,有人认为若将凝集素与特定的糖基作成三明治样的糖2凝集素2糖的结合物,特异性、灵敏度将会更高。而且能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合,从而在光镜与ö或电镜水平显示其结合部位。Newman等(1979)以荧光素标记凝集素PHA实验,发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。Kivela和Farkkanen(1987)用凝集素作为细胞特殊类型的标记实验发现,在人视网膜上PHA标记视锥细胞而不标记视杆细胞。在乳腺、乳腺上皮细胞呈PHA阳性反应,而肌上皮细胞和间质细胞呈PHA阴性反应。他以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明,刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏的各部,PHA和双花扁豆凝集素(DBA)主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞,荆豆凝集素(UEA)主要分布在血管内皮细胞,而麦芽素分布在肾小球。Streit和Kreutzberg(1987)发现GriffoniaSimplicifolia凝集素能特异性标记面神经节内的小胶质细胞,而其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞(Astro2cyte)等都显示阴性反应。如果在切断面神经后,增殖的小胶质细胞对GriffoniaSimplicifolia凝集素的反应加强。大量研究发现,凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。如张华忠等(1987)报道115例胃癌标记PHA阳性率高达90.43%,而正常胃粘膜基本是阴性,故认为PHA是胃癌的诊断性标志。BSA对乳腺恶性肿瘤阳性率达79%,而对良性病变均呈阴性反应,提示BSA可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。HRP本身虽含有甘露糖,能与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。但对其它的凝集素,需要将糖基化(Glycosylation)过氧化物酶结合到该凝集素上,且糖基化过氧化物酶品种尚有限,故目前本法在应用还有一定困难。免疫细胞化学技术尚在继续改进和完善中,除目前国内外已广泛应用的免疫金技术和免疫金银技术外,新的免疫细胞化学技术不断出现。1984年国外学者首次将CRNA探针应用于原位杂交,核酸探针为单链的RNA分子,产生自具有质粒逆转录系统的cDNA克隆。在1987年Wolf等建议插入确定长度的寡核苷酸至载体内产生cRNA分子,这种cRNA分子称为“寡核苷酸核酸探针”(oligoribo－probes),现在已被广泛的用于原位杂交实验。国内的杨春花等采用免疫组化和cDNA2mRNA原位分子杂交技术分别检测了24例RA,18例骨关节炎(OA)和6例正常滑膜组织中uPA,uPAR蛋白和mRNA的分布及表达情况。科研工作者根据免疫组织化学中材料的特性把同位素、生物素、光敏生物素、酶促生物素、地高辛标记cRNA上成功的制成探针。尤其地高辛与放射性标记相比,标记探针具有非放射性探针的优点,对人体无害,不受半衰期限制,探针可长期保存;与生物素标记探针相比,不受组织、细胞中内源性生物素的干扰,敏感性、分辨率较高,反应产物颜色鲜艳,反差好,背景染色低,制备探针可较长期保存,对人体无害等优点,已日益显示出它的优越性和广泛的应用前景。并且进一步研究发现它能根据需要人工用DNA合成仪合成,其长度及分子大小比较一致,可控地高辛同位素寡核苷酸探针。另外,放射性同位素、荧光素、生物素也能成功标记寡核苷酸作为探针,成功地运用于培养细胞、组织切片和染色体铺片等的原位杂交中。虽然有些人认为其敏感度不如来自质粒扩增的cRNA或DNA探针,但由于探针制备简便再加之于近年非放射性标记的成功,寡核苷酸探针在生物基础医学及临床学科领域中得到较为广泛的应用。免疫细胞化学技术与流式细胞术(FCM)结合进行多参数FCM分析血液淋巴细胞免疫表型(亚群)方法学因素对实验结果的影响。当血液采集后1h和6h测定淋巴细胞免疫表型结果差异无显著。如黄勇华等采用单标或双标直接免疫荧光标记法标记20种细胞表面分化抗原,经流式细胞仪测定。后进行分析185例白血病患者骨髓或外周血白血病细胞的免疫分型及CD117的表达细胞表面分化抗原(CD)117在各型白血病中的表达及其意义。免疫细胞化学技术先进仪器和方法结合已呈现新的趋势，如用荧光显微分光光度计和图像分析仪等定量检测,将结果客观打印、报告,这更适合于临床诊断和科学研究。如杨希谦等采用非放射碘标记人直