CRISPR-Cas技术

CONTENTS一、CRISPR-Cas系统的简介1，CRISPR/Cas系统的由来2，CRISPR/Cas系统的分类3，CRISPR/Cas系统的结构二、CRISPR-Cas系统的作用机理1，CRISPR间隔区的获得2，crRNA的表达和成熟3，外源基因的切割三、DSB的修复四、CRISPR-Cas系统的应用五、CRISPR技术的脱靶问题六、实验设计CRISPR/Cas9系统是一特殊的DNA重复序列家族，又命名为成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列，是目前用于基因敲除、点突变、基因插入、基因修复等基因编辑方面的新方法。CRISPR/Cass系统是从细菌和古生菌内发现的，它参与细菌的免疫过程，抵挡外源遗传物质的侵袭，是一种后天获得的防御系统。以往的基因编辑技术（ZFN/TALEN）一次只能编辑一个基因，并且耗时耗力。CRISPR/Cas9技术最大的优势就在于一次可以编辑很多个基因位点，只需设计多个不同的gRNA，它可以介导Cas9核酸酶进行多靶点基因编辑。CRISPR/Cas9技术可以通过核酸之间的相互识别，防止DNA甲基化对基因编辑的干扰。编辑效率显著高于ZFN/和ALEN。且不需要反复设计核算内切酶载体，操作简单。CRISPR/Cas9来源于细菌免疫系统，经过人为改造后，可在真核细胞中实现高度灵活且特异的基因组编辑。CRISPR/Cas9系统是一种后天免疫防御系统，用以保护细菌或古细菌免受外来质粒或噬菌体的侵入。当病毒首次入侵时，细菌会整合病毒基因到CRISPR的间隔区，当再次入侵时，CRISPR转录相应的crRNA，crRNA与病毒基因的同源序列结合，介导Cas酶切割病毒基因，从而保护自己。基于CRISPR-Cas基因保守型和位点构成的不同，可分为TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ三种类型。TypeⅠ和Ⅲ行较为复杂，Ⅰ类的特征蛋白是Cas3，在细菌和古生菌中都有。Ⅲ类的有Cas6和Cas10两种酶。TypeⅡ系统较简单只存在与细菌，主要是Cas9酶介导降解外源基因和crRNA的成熟。CRISPR-Cas系统目前广泛应用，由系统Ⅱ改造而的，为第三代人工核酸内切酶，比第一代（ZFN）和第二代（TALEN）的人工核酸内切酶操作更加简单、修饰更为精确、且成本低。CRISPR-Cas系统包括不连续的重复序列（Repeats）、间隔序列（Spacers）间隔排列成CRISPR簇、前导序列（L）和编码Cas酶的基因、tracrRNA基因。12Repeaeas两端序列是严格保守的分别为ＧＴＴＴ／Ｇ和ＧＡＡＡＣ／Ｇ，能使转录岀的RNA二级结构保持稳定。Spacers均为外源的DNA插入。前导序列可能在插入新的Spacers时起到识别作用或者作为转录CRISPR的启动子。Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA的引导下切割靶位点，Cas9具有HNH和RuvC两结构域，都可以切割DNA，其中HNH结构域切割互补的DNA链，RuvC切割非互补的DNA链。Cas9切割双链时无特异性，可作用于任何基因。12CRISPR之间的间隔区转录成前体cr-RNA（pre-crRNA），经核酸酶切割成熟，与tracrRNA结合成sgRNA，sgRNA具有特异性，作用于特定的基因序列。3实验时只需要改造CRISPR的部分序列，就可以得到针对特定基因的CRISPR/Cas系统。crRNA与tracrRNA碱基互补配对结合成gRNA，此复合物能引导核酸酶Cas9蛋白切割与crRNA配对的双链DNA。CRISPR间隔区的获得crRNA的表达和成熟外源基因的切割作用过程123噬菌体或质粒上与CRISPR－Cas9系统中间隔序列对应的序列被称为protospacer（PAM），一般为５‘－ＮＧＧ－３’。当外源基因入侵时，宿主识别PAM，以PAM附近的序列作为protospacer；把protospacer整合到CRISPR基因座的5’端的两个重复序列之间，从而获得相应的间隔区。前导区调控细菌CRISPR之间的间隔区转录为前体crRNA，反式激活crRNA（tracrRNA）与pre-crRNA重复序列互补介导核酸酶RnaseIII对pre-crRNA进行加工处理，切割成成熟crRNA。crRNA和tracrRNA结合成sgRNA，指导Cas9对外源基因进行切割。Cas9识别目的基因中的PAM片段，而crRNA识别ＰＡＭ的５′端互补的20bp的DNA序列片段（外源DNA），使基因组与Cas9稳定结合，从而对靶位点进行切割，基因组双链发生断裂，形成双链缺口（DSB）。在真核生物中DSB（DNA双链切口）可被两种不同的机体自身修复机制修复DSB——非同源性末端连接（NHEJ）和同源重组（HDR）进行修复。NHEJ能够高效地引入不同长度的插入或缺失突变（indel），产生由于移码突变而导致的基因功能受损，多用于细胞或动物模型中的基因敲除、功能基因组的筛查、转录调控和基因沉默的研究；HDR以DNA结构的同源性为基础，修复会带入特定位点的突变或在外源DNA供体模板存在下对靶点形成可预测的插入.此外还有一种微生物学介导的末端连接，这种在实验中比较少应用。除了DSB，实验时也能利用Cas9突变的“切口酶”形成单链切口（Nick），可通过同源重组（HDR）进行修复，以完整的链为模板修复缺口。基因敲出：如向受精卵中注射Cas9mRNA和sgRNA、构建gRNA-Cas质粒结合非同源重组进行基因的敲除。构建sgRNA文库进行基因组筛查和药物靶点的鉴定。基因表达调控：改造成转录激活因子、转录抑制因子等调节蛋白对基因表达进行调控。如使Cas9两个活性位点突变形成dCas9，dCas9不切割DNA，而是引导抑制因子或转录因子的结合到靶位点上，从而达到抑制基因的表达或激活基因的表达。目标位置可以是启动子区域、调控区域或早期编码区域。脱靶现象是基因编辑实验的资格重要问题，CRISPR/Cas的脱靶受到sgRNA、PAM、Cas9等的影响。实验时可以通过设计优化的sgRNA、控制Cas9-sgRNA的用量、改造Cas9、选着合适的PAM系列和适中的酶浓度等方法降低脱靶率。六、实验设计实验思路提出生物问题选着操作方式是敲除基因，还是编辑基因或上调表达或抑制表达？是全基因操作还是单基因操作？选择表达系统和传递方式选着合适的载体设计gRNA并进行克隆传递CRISPR组件和验证你的基因组编辑用CRISPR-Cas9技术筛选跟肿瘤转移密切相关的基因实验过程以高度转移的肿瘤细胞株作为模式细胞，筛选跟肿瘤转移密切相关的基因。构建gRNA腺病毒质粒文库，用于靶基因位点的敲除：①以质粒为载体，通过在线软件设计设计gRNAs文库，质粒载体中需包含有gRNA、嘌呤毒素抗性基因。②对gRNA文库进行扩增。③把gRNA文库合并到腺病毒中。④转染细胞时，腺病毒会把质粒传递到细胞中。实验过程构建reporter腺病毒载体:把荧光蛋白报告基因（FP）整合到腺病毒上合成报告因子，载体中需要包含有包含有Cas9和报告基因。表达形成Cas9-FP复合物，gRNA序列会将dCas9-FP融合物导向特定的基因组序列。（荧光蛋白载体和gRNA载体可通过addgene网站获取）制备高度转移的肿瘤单细胞悬液。用构建好的gRNA腺病毒转染肿瘤细胞。在培养基中加入嘌呤毒素筛选出转染成功的细胞。裂解细胞提取质粒DNA。通过酶切电泳鉴定和DNA测序鉴定。实验过程把构建好的reporter载体转染到筛选出来的肿瘤细胞中，以reporter转染空肿瘤细胞做空白对照。培养一段时间后，通过荧光显微镜观察细胞荧光表达情况。制备单细胞悬液。用流式细胞仪分选出突变的细胞并进行扩大培养。对发生突变的细胞进行单克隆培养。提突变的肿瘤细胞基因组DNA。PCR扩增。实验过程基因测序，以没转染的细胞做空白对照，检测突变细胞序列的突变情况。提取突变细胞的蛋白质。通过Westernblose验证突变细胞的蛋白质表达情况。筛选出gRNA高表达的成功敲除的肿瘤细胞。用Transwell侵袭实验检测突变的肿瘤细胞和没突变的肿瘤细胞的迁移能力。知识回顾KnowledgeReview祝您成功！