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色谱分析技术在植科专业相关实验和教学中的应用2011—2012学年第一学期课程名称：仪器分析班级：09级植物科学与技术（2）班学号：学生姓名：摘要：本文通过对色谱分析的一些方法的简要分析和与我们植物保护学院植物科学与技术专业的联系来向大家论述相关知识和信息。我们专业有许多实验都要借助于色谱分析方法才能够圆满的完成相关实验。因此，色谱分析技术在我们专业能够得到很好的运用与发挥。同时也因为色谱分析方法的发展才引领了科技的进步，进而取得了一系列的科技成果。关键词：色谱；实验；化学；应用正文：一、色谱分析法的起源、分类及其原理1、色谱分析法的起源[1]色谱法起源于20世纪初，1906年俄国植物学家米哈伊尔·茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特将这种方法命名为Хроматография，这个单词最终被英语等拼音语言接受，成为色谱法的名称。汉语中的色谱也是对这个单词的意译。2、色谱分析法的分类[2]色谱分析法根据流动性的性质可以分为：气相色谱分析法和高效液相色谱分析法两种。气相色谱分析法具有高分离效能、高检测性能、分析时间快等优点，因此应用比较广泛。而高效液相色谱分析法也因其高效、快速而得以广泛应用。根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。3、色谱分析法的简单原理[3]色谱分析法是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理以获得分离的方法。其过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。二、色谱分析法在相关学习实验中的应用1、植物生理学相关实验（1）、叶绿素的提取与分离实验[4]先从菠菜叶片中，用有机溶剂将叶片中的色素提取出来；然后利用纸层析，在圆形的滤纸中心用毛细管进行点样（少量多次，尽量均匀，形状规则）；再以汽油做扩散剂将叶绿素进行扩散，进而得到叶片内色素的主要成份。此试验应用的纸层析法是色谱分析法的一种较常用的方法，不仅见效快、成本低、现象明显、重复性强，而且易于操作，适合于教学研究和学生实验，同时也有利于色谱分析法的发展。（2）、植物组织呼吸强度及呼吸商的测定的实验[5]用直径4mm和2000mm的色谱柱装上担体。采用热导检测器[6]检测，柱温为60℃，进样器温为40℃，以氦气为载气，气体流速为20ml/min；再用微量注射器分别抽取不同量的纯O2和纯CO2，注入气相色谱仪中，并记录O2和CO2出峰时间和不同量的峰值。进而描绘出进样量中O2和CO2的绝对量和峰值的标准曲线。然后运用相关知识计算植物组织呼吸强度及呼吸商的测定的实验。2、分子生物学相关实验(1)、糖蛋白的分离和纯化实验[7]糖蛋白是存在与植物体内的一种大分子化合物，本实验主要运用三种色谱柱（SepharoseCL－6B、S－Sepharose、SynChropakRP－PC16）依次进行分离和纯化。首先，使用SepharoseCL－6B色谱柱进行初步的分离，然后再将流出液通过S－Sepharose色谱柱进行初步的纯化，使得样品中的各组分的分离更彻底，最后用SynChropakRP－PC16色谱柱进行最终的纯化，最后将吸附柱上的大分子洗脱出来，一般用0.1%TFA和65%乙腈进行脱洗28分钟即可得到纯品。3、生物化学相关实验（1）、检验莨菪碱和东莨菪碱的分离效果实验[8]用碱性氧化铝作为吸附剂，撤在玻板上，然后路套有调节荡层厚度的塑料环的破棒置于玻板一端，用手推至另一线即可。然后，用样品进行点样，接着用有一定倾斜度的薄层色谱进行展开；最后对其进行显色，用改良德氏试剂喷雾显色。显色剂用小型喷雾器喷出，雾点要小，与薄层保持一差距离，或可在展开剂尚未蒸干以前喷雾显色，以免将薄层表面吹坏。如果分离效果好，则显色后共显现两个斑点，莨菪碱及东莨菪碱各显一个斑点。（2）、从绿色叶片中制备线粒体实验[9]试验前供拭材料放在暗处2—3天，取材前再给光照I一3小时，这种暗处理消除了细胞中大量淀粉，有利于相系统中的分配行为。试验材料为生长健壮的嫩叶片。首先将较大的叶脉除去，然后取100g叶片、洗净、剪碎加200m1冷的A液。在4℃下于组织捣碎机中高速匀浆2次，每次5—7秒钟。8层妙布过滤。滤液以600xg离心10分钟。上清液再以11000xg离心10分钟．沉淀悬浮于B液，并用B液洗2次。用11000xg离心l0分钟收集沉淀。此即线粒体的粗制品。线粒体的纯化是在Dextran—PEG相[10]系统中进行的。相系统的成分为：6.1％DextranT500，6.1％PEG、2mMKCl、0.3M蔗糖和5mM磷酸钾缓冲液(pH7.8)。新制备的相系统，放置约1小时就可以形成明显的上下两相。此时Dextran分布在下相，PEG在上相。取5m1上相液悬浮线粒体粗制品。再加入4ml下相液，充分混合后，用600xg离心3—4分钟。此时大部分叶绿体颗粒及色素分配到上相，所以上相为绿色。尤其在上层的界面处分布着大量叶绿体颗粒。而在下相液中游离色素和叶绿体颗粒很少，几乎为白色透明液体。在下相液的界面处分布着大量的线粒体。小心地吸出绿色的上相液。注意不要破坏它的界面，以免把线粒体带出。然后再加入5m1新的上相液，与下相液充分混合后，依照以上步骤，重复分配2次。最后用7倍体积的B液稀释含线粒体的下相液，并用500xg离心3分钟，上清液再以11000xg离心10分钟收集沉淀，此即纯化的线粒体。4、植物化学相关实验（1）、从番茄中提取番茄红素和β—胡萝卜素[11]首先，将新鲜番茄洗净，捣碎成浆状后，称取15g左右放人烧瓶中，添加20ml95％乙醇，热水浴回流5分钟，温度不应高于85℃，趁热过滤，滤渣转移至烧瓶备用；然后，向烧瓶中加人20ml二氯甲烷，热水浴回流7分钟（温度应低于55℃）,冷却，过滤，滤渣转移回烧瓶，再添加10ml二氯甲烷，重复操作,合并乙醇和两次二氯甲烷的提取液，倒入分液漏斗中，添加5ml饱和氯化钠溶液，振荡，静置,分出有机相，用无水硫酸钠干燥,过滤，将滤液蒸馏以回收大部分溶剂，所剩溶液继续在通风橱内水浴蒸干备用；最后，用氧化铝装柱，石油醚洗脱。开始之前，应将自制的有色物料平铺在氧化铝上，用滴管添加少许石油醚后，打开活塞，放出石油醚，直至与柱顶平齐。黄带（β一胡萝卜素）移动快，红带（番茄红素）移动慢。待黄带完全从柱上洗去后，换用氯仿继续洗脱红带。将两份洗脱液在通风橱内水浴蒸干，得到的就是两种较纯的色素。（2）、槲皮素与金雀异黄素的分离与提纯实验[12]槲皮素(quercetin)、金雀异黄素(genistein)同属于黄酮类化合物，具有广泛的抗肿瘤、抗血小板、抗氧化等药理作用[13～14]。首先，精确配制SDS浓度为0.0081，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05mol·L-1的水溶液作为展开剂(0.0081mol·L-1为SDS的CMC)进行实验，并在一定浓度下依次分别加入体积分数为2%，4%，6%，8%的甲醇、异丙醇、正戊醇、正丁醇、冰乙酸。新华三号滤纸切割成2.5cm×12cm的纸条，毛细管点样。药品溶解在甲醇中，展开前层析缸密闭，以展开剂蒸气饱和1h，上行法展开约10cm左右。点样量：Q，Q1，Q2均为0.5μl，而G，G1，G2则均为2μl(因G，G1，G2的检出灵敏度较低)。然后，以10g·L-1FeCl3溶液喷洒后，各药品点显紫黑色，以初步鉴定样品酚型结构的存在。在365nm的紫外光照射下，对原始样品点、非SDS溶液展开并经50g·L-1AlCl3甲醇溶液喷洒的样品迁移点、SDS胶束水溶液展开并经50g·L-1AlCl3甲醇溶液喷洒的样品迁移点,3种不同情况下的荧光表现进行比较。三、现代色谱分析法的应用近年来，有越来越多的色谱分析成果问世，比如：多孔性聚合物填料在高效液相色谱中的应用、高速逆流色谱技术在植物特殊化学成分研究方面的应用、智能色谱的诞生及其应用以及超临界流体色谱的迅猛发展等等。这些都极大的促进了当今世界科技的快速发展，反过来快速发展的科技又给色谱分析技术的发展提供的动力。这种“双赢”的局面正迎合了这个信息高速传播、生活娱乐节奏加快的当今世界，是一个良好的循环发展系统。相信色谱分析技术必定能够更好更快的发展。参考文献：[1].王瑞芬.现代色谱分析法的应用.北京：冶金工业出版社,2006[2].敖潇潇.分析化学中的色谱法分类.河南：河南科技杂志,2011[3].李艳红.分析化学.北京:石油工业出版社,2008[4].陈建勋.植物生理学实验指导.广州：华南理工大学科技出版社,2002[5].李合生.植物生理生化实验原理和技术.北京：高等教育出版社,2000[6].杜斌.实用现代色谱技术.河南：郑州大学出版社,2009[7].师治贤.生物大分子的液相色谱分离和制备.北京：科学出版社,1996[8].张志良.植物生物化学技术和方法.北京：农业出版社,1986[9].B.L.威廉斯，K威尔逊编.实用生物化学原理和技术.北京：科学出版社,1979[10].郅文波,邓秋云,宋江楠等.高速逆流双水相色谱法纯化卵白蛋白.生物工程学报,2005[11].陈亚.有机化学实验.昆明:云南科技出版社,2004[12].刘文,邓亦峰,梁念慈.槲皮素和金雀异黄素硫酸酯合成方法的改进及其HPLC-MS的鉴定.中药材JOURNALOFCHINESEMEDICINALMATERIALS,2008[13].IokuK,TsushidaT,Takeietal.Antioxidativeavtivityofquercetinandquercetinmonoglucosideinsolutionandphospholipidbilayers.BiochimBiophysActa,1995,1234(4):99.[14].BarnesS,PetersonTG.Biochemicaltargetsoftheisoflavonegenisteinintumorcelllines.TheSocietyforExperimentalBiologyandMedicine,1995,208:103.