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书书书唐古特白刺组织培养及其培养基筛选研究郭晔红，蔺海明，武睿（甘肃农业大学农学院，甘肃兰州７３００７０）摘要：本试验选用唐古特白刺幼嫩茎段和叶片作为材料，研究白刺不同外植体的离体培养技术及其适宜的培养基。结果表明，白刺带芽嫩茎是诱导丛生芽的良好外植体，恒温２０℃以下，可有效降低白刺丛生芽初代培养污染严重的程度；叶片是诱导愈伤组织的良好外植体，且低浓度生长素２，４Ｄ培养基较高浓度培养基形成的白刺愈伤组织致密，也不易褐化。白刺的最适增殖、壮芽培养基为ＭＳ＋６ＢＡ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ１．００ｍｇ／Ｌ，而且是以腋芽形成丛生芽的方式进行增殖的；最适生根培养基是１／２ＭＳ＋ＫＴ１ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ；形成愈伤组织较好的培养基是ＭＳ＋２，４Ｄ０．５～１．０ｍｇ／Ｌ。关键词：唐古特白刺；组织培养；培养基；愈伤组织中图分类号：Ｑ９４３．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０６００５９０６ 唐古特白刺（犖犻狋狉犪狉犻犪狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿）为蒺藜科（Ｚｙｇｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）白刺属（犖犻狋狉犪狉犻犪）植物，别名沙樱桃，俗称地枣，是典型的沙旱生植物，在防风固沙、保护沙区绿洲中发挥着重要作用，白刺根寄生的锁阳（犆狔狀狅犿狅狉犻狌犿狊狅狀犵犪狉犻犮狌犿），为传统名贵的温补药材［１］。近年来，从野生植物资源中寻找新的、潜在的药食同源植物，已成为国内外学者研究的热点，而沙旱生植物白刺则是经过长期的自然筛选而保留下来的优胜者之一，白刺因其顽强的生命力和优良的遗传基因而受到沙区人民的喜爱［２］。白刺果有调节血糖、血脂、降血压，显著提高人体免疫力、抗疲劳、抗寒冷、增进睡眠等功效，白刺主要有效成分总糖、维生素Ｅ、铁、钙、必需氨基酸及黄酮类含量较高，因此还具有开胃健脾，预防和治疗心脑血管疾病，抗衰老，滋补强体，保护化学性肝损伤的功效，白刺果不仅可以食用，以它为优势种和建群种构成的草地还是我国风沙干旱地区家畜重要的天然牧场。白刺在中国的分布主要是新疆和甘肃省，甘肃以河西走廊为白刺的主要分布区，总面积达１８．８万ｈｍ２，然而白刺品质退化相当严重，同时白刺种子存在高度休眠问题，这为人工大面积栽培和良种选育带来了很大的困难，离体繁育技术则是保持白刺优良性状稳定性的重要途径之一［３，４］。国内外许多学者主要从植物生长量、生理特性及经济利用等方面对白刺灌丛进行了研究，任臖和陶玲［５］对白刺属植物的生长效益进行了分析，贾宝全等［６］研究了白刺灌丛沙包生物量的模型，常兆丰等［７］研究了白刺群落的自然更新，但是从药食同源的角度对白刺进行组织培养的研究还少有所闻。王晨霞和陈贵林［８］进行了西伯利亚白刺的组织培养与快速繁殖的研究，张红晓和康向阳［９］虽然对白刺组织培养和快速繁殖已有报道，但主要集中在组织快繁体系建立方面。王前等［１０］用不同激素浓度研究半夏植株再生结果认为，２，４Ｄ丁酯（２，４Ｄ）、吲哚乙酸（ＩＡＡ）和萘乙酸（ＮＡＡ）有利于半夏（犘犻狀犲犾犾犻犪狋犲狉狀犪狋犪）外植体的诱导，激动素（ＫＴ）对块茎的诱导率影响不大。而对白刺组织培养接种材料与培养基协同作用进行研究的还未见报道，唐古特白刺具有果实圆润饱满、酸甜可口，有效成分高的优势，而且唐古特白刺寄生的中药材锁阳品质较其他白刺种优良，因此本试验通过研究白刺接种材料与培养基协同作用，旨在确定唐古特白刺的最佳组培材料与最佳培养基，为保持其优良性状和白刺资源快速更新复壮提供理论和技术依据。１ 材料与方法１．１ 材料本试验所采用的材料为唐古特白刺，于２００７年５月中旬采自甘肃省靖远县，天气晴朗的午后１４：００－１６：００第１８卷 第６期Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６草 业 学 报ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ ５９－６４２００９年１２月收稿日期：２００９０５２５；改回日期：２００９０８１０基金项目：甘肃省农牧厅农业生物技术专项（ＧＮＳＷ２００７０７），甘肃省教育厅项目（０７０２１３）和甘肃省星火计划项目（５ＨＳ０６５Ａ９１００１０６）资助。作者简介：郭晔红（１９６８），女，内蒙包头人，副教授，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｇｕｏｙｈ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｎｈｍ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ时剪取当年生旺盛新枝，将白刺带芽和叶片茎段切成长４～５ｃｍ，带回实验室备用。在离体培养过程中，外植体是决定培养是否成功的关键因素之一，大多数植物在其生长刚开始的季节采样较好，若在生长末期或休眠期采样，外植体在培养中则往往反应迟钝或不能培养成功［１１］。外植体灭菌：将带回来的白刺茎段先用毛刷蘸洗涤剂溶液轻轻地刷洗，将刷洗后的茎段和叶片置于烧杯中，用纱布封口后流水冲洗２～３ｈ后，在超净工作台上，先用７０％乙醇浸泡３０ｓ，再用０．１％升汞浸泡６ｍｉｎ进行灭菌，然后立即用无菌水冲洗４～６次，用灭菌滤纸吸干表面水分，用灭过菌的剪刀剪成约１．５ｃｍ左右的单芽茎段，叶片沿叶脉剪几个裂口，接种于已灭菌的诱导培养基上［１２，１３］。１．２ 培养条件试验所采用的基本培养基是ＭＳ培养基，附加各种激素，每升培养基加糖３０ｇ，琼脂４．６ｇ，ｐＨ值调为５．８～６．０。组培室条件为温度２５℃，光照度为２０００～３０００ｌｘ，光照时间为１４～１６ｈ／ｄ［１４］。１．３ 方法１．３．１ 启动培养 愈伤组织诱导选择白刺叶片为外植体，再分别附加０．５，１．０，１．５，２．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ，在ＩＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ＋６苄氨基嘌呤（６ＢＡ）０．２ｍｇ／Ｌ的ＭＳ培养基上进行诱导培养，依次用Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４表示，以不加２，４Ｄ的ＭＳ培养基作对照，用ＣＫ表示，３次重复，３０ｄ后统计出愈率、死亡率及愈伤组织生长状况。丛生芽的诱导采用不同的诱导培养基：吲哚丁酸（ＩＢＡ）０．５，１．０，１．５ｍｇ／Ｌ分别接种于ＭＳ和１／２ＭＳ培养基上，分别以不加ＩＢＡ培养基作对照，３次重复。１．３．２ 增殖培养 增殖培养选择ＭＳ培养基，分别添加６ＢＡ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．２５ｍｇ／Ｌ、６ＢＡ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ、６ＢＡ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．７５ｍｇ／Ｌ、６ＢＡ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ１．００ｍｇ／Ｌ和６ＢＡ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ１．２５ｍｇ／Ｌ，依次用Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５表示，并用６ＢＡ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０ｍｇ／Ｌ作对照，用ＣＫ表示。每次接种２０个茎段，增殖培养３０ｄ后统计增殖系数和芽生物量，３次重复（统计数据均为３次试验结果的平均值）。增殖系数＝增殖后有效芽数／接种芽数芽生物量＝［增殖后试管苗重（ｇ）－增殖前试管苗重（ｇ）］／增殖芽数１．３．３ 生根培养 生根培养基分别选择：１／２ＭＳ＋ＫＴ０．５ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ１ｍｇ／Ｌ、１／２ＭＳ＋ＫＴ１ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ、１／４ＭＳ＋ＫＴ２ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ和１／４ＭＳ＋ＫＴ１ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ；每１处理重复３次。２ 结果与分析２．１ 启动培养２．１．１ 愈伤组织的诱导 以ＭＳ为基本培养基，研究不同浓度生长素２，４Ｄ对白刺叶片愈伤组织的诱导，并筛选白刺叶片愈伤组织诱导的最适培养基。经过１０～１５ｄ的培养，可观察到白刺叶片周围有膨大组织的形成，可见单独使用生长素２，４Ｄ能有效诱导白刺叶片形成愈伤组织（图１ａ）。高浓度生长素２，４Ｄ对白刺叶片愈伤组织的诱导存在抑制作用，且与低浓度处理呈极显著性差异（犘＜０．０１）（表１）。而低浓度对其有促进作用，当浓度在０．５～１．０ｍｇ／Ｌ时诱导效果较好，白刺出愈率达７８％～８５％。试验还发现高浓度时形成的愈伤组织较松散，且易褐化；而低浓度时形成的愈伤组织较致密，不易褐化。因此，低浓度的生长素２，４Ｄ对白刺叶片愈伤组织诱导效果较好，Ｔｕｌｙａｇａｎｏｖ等［１５，１６］在对西伯利亚白刺（犖．狊犻犫犻狉犻犮犪）的研究中也得出过相同结论，本试验结果是当培养基的生长素２，４Ｄ浓度为１ｍｇ／Ｌ时，对白刺叶片愈伤组织诱导效果最好，出愈率达８５％，并与其他处理呈极显著性差异（犘＜０．０１）。２．１．２ 丛生芽的诱导 本试验选取带芽茎段为外植体，设计不同培养基及ＩＢＡ浓度，观察白刺丛生芽的诱导情况，来确定白刺丛生芽诱导的最佳启动培养基。结果表明，白刺带芽嫩茎在只加生长素ＩＢＡ的培养基上很快诱导腋芽分化出芽。在白刺丛生芽的诱导中，初代培养污染特别严重，用上述方式处理，污染率达到６０％，而用升汞处理８ｍｉｎ以上，又导致外植体的死亡，研究还发现，在恒温２０℃以下，可有效减少污染，在室温下接种第２天就出现污染，第４天则全部污染，而恒温２０℃以下，污染可减少到３０％左右，接种１０ｄ后，接种的白刺单芽茎段可长出叶片（图１ｂ）。０６ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９）Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６图１ 白刺组织培养过程犉犻犵．１ 犉狅狉犿犪狋犻狅狀狆狉狅犮犲狊狊狅犳犖．狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿狋犻狊狊狌犲犮狌犾狋狌狉犲ａ：白刺丛生芽培养Ｔｕｆｔｅｄｓｈｏｏｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｂ：白刺叶片愈伤诱导Ｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｅｄｆｒｏｍｌｅａｆ；ｃ，ｄ：：白刺生根培养Ｒｏｏｔｉｎｇ ＭＳ培养基附加ＩＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ可更好地诱导白刺嫩茎出芽，诱导率达１００％，并与其他处理相比呈极显著性差异（犘＜０．０１）。在同一基本培养基下，随着生长素ＩＢＡ浓度升高，其对丛生芽的诱导存在抑制作用，在ＭＳ培养基上，当生长素ＩＢＡ的浓度从０．５升高到１．０ｍｇ／Ｌ时，诱导率呈显著下降趋势（犘＜０．０５），升高到１．５ｍｇ／Ｌ时呈极显著下降趋势（犘＜０．０１）；在１／２ＭＳ培养基上，随生长素ＩＢＡ的浓度升高，各处理之间诱导率均呈极显著下降趋势（犘＜０．０１）；这一结果也得到了王友生等［１７］对三叶草（犜狉犻犳狅犾犻狌犿犺狔犫狉犻犱狌犿）和袁学军等［１８］对假俭草（犈狉犲犿狅犮犺犾狅犪狅狆犺犻狌狉狅犻犱犲狊）组织培养研究科学结论的支持；而在不附加生长素ＩＢＡ时，均不能诱导白刺产生丛生芽。２．２ 增殖培养以ＭＳ为基本培养基，固定细胞分裂素６ＢＡ的表１ 不同浓度２，４犇对白刺叶片愈伤组织诱导的影响犜犪犫犾犲１ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狅犳２，４犇狅狀犖．狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿犾犲犪犳犮犪犾犾狌狊犻狀犱狌犮犻狀犵培养基Ｍｅｄｉｕｍ激素Ｈｏｒｍｏｎｅ２，４Ｄ（ｍｇ／Ｌ）接种外植体数Ｎｏ．ｏｆｅｘｐｌａｎｔｓ出愈率Ｃａｌｌｕｓｒａｔｅ（％）ＣＫ０．０６００．０ＥＤ１０．５６０７８．０ＢＤ２１．０６０８５．０ＡＤ３１．５６０６５．０ＣＤ４２．０６０５３．７Ｄ 注：同列中，标有不同大写字母者差异极显著（犘＜０．０１），标有不同小写字母者差异显著（犘＜０．０５），下同。 Ｎｏｔｅ：Ｖａｌｕｅｓｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｕｐｐｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｗｉｔｈｉｎｌｉｎｅｓｄｉｆｆｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（犘＜０．０１），ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｗｉｔｈｉｎｌｉｎｅｓｄｉｆｆｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（犘＜０．０５），ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．１６第１８卷第６期草业学报２００９年量为２ｍｇ／Ｌ，研究不同浓度萘乙酸（ＮＡＡ）对白刺外植体芽增殖的影响，并确定其增殖的最佳培养基。白刺芽的增殖系数和生物量均随ＮＡＡ浓度的增大而增加（表３），但当ＮＡＡ浓度超过１ｍｇ／Ｌ时，增殖系数和生物量均呈极显著下降趋势（犘＜０．０１），即过高浓度的ＮＡＡ对白刺增殖培养有抑制作用。当ＮＡＡ浓度为０．２５～１．００ｍｇ／Ｌ时，愈伤组织的生物量随其浓度的增加而增加，且０．７５～１．００ｍｇ／Ｌ的ＮＡＡ浓度可极显著（犘＜０．０１）提高白刺芽的增殖系数和生物量，说明适当浓度的萘乙酸对白刺愈伤组织的形成有促进作用。由此推断，白刺芽增殖的最适培养基是：ＭＳ＋６ＢＡ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ１．００ｍｇ／Ｌ。表２ 不同培养基对白刺丛生芽诱导的影响犜犪犫犾犲２ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犿犲犱犻狌犿狅狀犖．狋犪狀犵狌