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第七章色谱分离技术概述吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法高效液相色谱法亲和色谱法色谱法色谱分离基本原理：使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。处于柱起始端的样品中各组份与两相进行不同程度的作用。与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，而与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差异，使得混合组份最终形成各个组份的“带(band)”或“区(zone)”，对依次流出的各个组份物质可分别进行定性、定量分析。2.色谱法的特点（1）概念色谱法是一种物理的分离方法，利用不同物质在两相中具有不同的分配系数，并通过两相不断的相对运动而实现分离的方法。其中一相是固定相，通常是表面积很大的或多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。流动相流经固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离；或者说，易分配于固定相中的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，因而逐步分离。（2）基本特点：①分离效率高。其效率是所有分离纯化技术中最高的，这种高效的分离尤其适于极复杂混合物。②应用范围广。（非）极性、（非）离子型、小分子和大分子、无机和有机及生物活性物质、热（不）稳定化合物；尤其是对生物大分子的分离，其他方法无法取代。③选择性强。可变参数很多：不同的色谱分离方法、固定相和流动相、操作条件。④设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件，因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子有机化合物。缺点：处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此主要用于实验室，工业生产上应用较少。3.色谱法的分类分离机理操作方法流动相的物态实验技术吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法亲和色谱法柱色谱法纸色谱法薄层色谱法气相色谱法液相色谱法迎头法顶替法洗脱分析法4.色谱分离方法的选择初级代谢产物：氨基酸、有机酸、核苷酸、单糖类、脂肪酸次级代谢产物：生物碱、萜类、糖苷、色素、鞣质类、抗生素生物大分子：蛋白质、酶、多肽、核酸、多糖目的产物色谱分离方法的选择依据：①目的产物的分子结构、物理化学性质及相对分子质量；②主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特性与目的产物相近的杂质成分与含量；③目的产物在色谱分离过程中的生理活性的稳定性。二、吸附色谱法依靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离的方法。吸附剂是一些多孔性物质，表面布满许多吸附位点，即活性中心。吸附色谱过程就是样品中各组分的分子与流动相分子不断争夺吸附剂活性中心并不断达到平衡的过程。被吸附的物质称为吸附物。吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢键或化学键。（一）基本原理溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。1.发生吸附作用的原理：固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子）所处的状态不同：固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处于平衡状态。界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零，合力指向固体内部。2.吸附的类型：物理吸附化学吸附交换吸附物理吸附化学吸附产生方式分子力（范德华力）库仑力(电子转移，生成化学键)活化能低高进行温度低温高温释放热量小很大速度较快，容易达到平衡慢，平衡慢选择性不严格强交换吸附：吸附剂表面如果由极性分子或离子组成，则会吸引溶液中带相反电荷的离子形成双电层，同时放出等物质的量的离子，发生离子交换。离子的电荷是决定因素，离子所带电荷越多，在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力越强。电荷相同的离子，水化半径越小，越容易被吸附。3.常用的吸附剂：有机吸附剂：无机吸附剂：活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙、氢氧化铝按化学结构分4.吸附色谱的基本过程和分类固定相对各组分吸附力的大小次序：（1）过程（2）分类吸附薄层色谱法柱色谱法操作方法的不同5.吸附薄层色谱法（thinlayerchromatography,TLC）薄层色谱法：将吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上，铺成一薄层，然后把要分离的样品点到薄层的起始线上，用合适的溶剂展开，最后使样品中各组分得到分离。（1）原理：利用混合物中各组分的物理化学性质的差异，在层析过程中，在不相溶的两相中分布不同，从而达到分离的目的。吸附剂：涂布在薄层板上（固定相）展开剂：在展开过程中流过固定相的溶剂（流动相）两相将待分离的样品溶液点在薄层板的一端，在密闭的容器中用适宜的溶剂（展开剂）展开。当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、解吸附、再吸附、再解吸附。由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同：对极性大的物质吸附力强，对极性小的物质吸附力弱。移动速度的不同：易被吸附的物质相对移动较慢，在薄层板上移动的距离就小；较难被吸附的物质移动较快，移动的距离大。经过一段时间的展开，不同物质就被彼此分开，最后形成互相分离的斑点。将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后，用特定的方法使斑点显色，达到定性和定量的目的。（2）吸附剂和展开剂的选择：吸附剂：氧化铝、硅胶和聚酰胺展开剂：由实验确定。极性越大，对物质的洗脱能力越强（3）基本操作薄层色谱板的制备点样展开显色①薄层板的制备：在一块玻璃板（薄厚一致，表面光滑平整）表面涂上很薄的吸附剂，如硅胶或氧化铝等。(--涂布)为了增加薄层的牢固性且易于保存，可在涂布过程中加入某些黏合剂。如羧甲基纤维素钠（CMC-Na）②点样：用毛细管吸取样品溶液，轻轻接触到薄层上，使样品自动吸到薄层上。1.5–2cm直径3mm③展开：在密闭容器中进行：层析缸。最常用的展开法：上行展开法薄板放入层析缸时，切勿使溶剂浸没样品点。当溶剂移动到接近薄板上端边缘时，取出薄板，划出溶剂前沿。④显色：也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的混合物各组分斑点呈现颜色。每类化合物都有特定的显色剂。各类物质常用的显色剂和万能薄层显色剂显色的方法：喷雾显色法紫外线照射法碘蒸气显色法生物显迹法有些化合物在紫外灯下会产生荧光或暗色斑点在充满碘蒸气的容器中，多数天然药物成分会产生棕色斑点抗生素等生物活性物质每类化合物都有特定的显色剂6.吸附柱色谱法（1）基本原理同薄层色谱法。吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺、活性炭（2）色谱柱：玻璃柱柱色谱装置（3）基本操作装柱上样洗脱吸附剂干法装柱湿法装柱被分离物质干法上样湿法上样梯度洗脱，各组分先后被洗出三、分配色谱法分配色谱法：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而进行分离的方法。分配色谱法：利用被分离物质中各成分在两种不相混溶的液体之间的分布情况不同而使混合物得到分离。（相当于一种连续性的溶剂提取方法，只是把其中一个溶剂设法固定，用另一种溶剂来冲洗，这种分离不经过吸附程序，仅由溶剂的提取而完成，所以叫~。）（一）基本原理固定相：固定在柱内的液体流动相：用作冲洗的液体载体：使固定相停留在柱内的固体在洗脱过程中，流动相与固定相发生接触，由于样品中各成分在两相之间的分布不同，因此向下移动的速度不同，易溶于流动相中的成分移动快，而在固定相中溶解度大的成分移动慢，因此得到分离。（溶解度）将含固定相的载体装在柱内加入被分离溶液洗脱分离：（二）载体、固定相和流动相的选择1.载体的选择惰性、无吸附能力、能吸留较大量固定相。主要有硅胶、硅藻土、纤维素，聚乙烯粉2.固定相的选择水、缓冲液、酸的水溶液“反相层析法”：有机溶剂作固定相3.展开剂的选择（三）基本操作装柱上样洗脱四、离子交换色谱法与离子交换法的区别？离子交换法：应用离子交换剂作为吸附剂，通过静电引力将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂上，然后用合适的洗脱剂将吸附物从离子交换剂上洗脱下来，从而达到分离、浓缩、纯化的目的。离子交换树脂组成活性离子离子交换色谱法的固定相应该是什么？离子交换色谱法：利用离子交换树脂作为固定相，以适宜的溶剂作为流动相，使溶质按它们的离子交换亲和力的不同而得到分离的方法。利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离方法。基本原理：带电物质因电荷力作用而在固定相和流动相之间分配得以相互分离。两性电解质（蛋白质、氨基酸）在不同溶液中所带的净电荷的种类和数量不同：pH=pI;pHpI；pHpI?溶液pH偏离pI越远，则净电荷量越大。由于各种蛋白质等生物大分子的等电点不同，可以通过改变溶液的pH和离子强度来影响它们与离子交换树脂的吸附作用，从而将它们分离。离子交换树脂（固定相）的性质、种类、选择依据、离子交换色谱的操作及应用五、凝胶色谱法凝胶色谱法：以凝胶为固定相、基于分子大小不同而进行分离的一种方法。因其整个过程和过滤相似，又称凝胶过滤、分子筛过滤等。凝胶：一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体，当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于凝胶孔径的大分子由于不能进入胶粒内部，便随着溶剂在胶粒间隙向下移动并最先流出柱外；直径小于凝胶孔径的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。这样不同大小的分子由于所经的路径不同从而得到分离，大分子物质先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来。（一）原理小分子（二）凝胶过滤介质基本要求：不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用高物理强度、高化学稳定性耐高温高压、耐强酸强碱高化学惰性内孔径分布范围窄颗粒大小均一度高常用的凝胶过滤介质葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶1.葡聚糖凝胶应用最广泛的一类凝胶。由葡聚糖Dextran交联而得。在制备凝胶时添加不同比例的交联剂可得到交联度不同的凝胶。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫做交联度。交联度大：网状结构紧密，吸水量小交联度小：网状结构疏松，吸水量多化学性质比较稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液2.琼脂糖凝胶来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶，不是共价交联，而是以氢键交联，键能较弱。孔隙度通过改变琼脂糖浓度而达到（与葡聚糖不同）（联系琼脂糖凝胶电泳）化学稳定性：琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶没有干胶，必须在溶胀状态保存。能分离几万至几千万高相对分子质量的物质，分离范围随着凝胶浓度上升而下降，颗粒强度随浓度上升而提高。适用于核酸、多糖和蛋白质类物质的分离。3.聚丙烯酰胺凝胶人工合成，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。对芳香族、杂环化合物有不同程度的吸附作用。（三）操作方法凝胶的预处理层析柱的选择凝胶柱的装填样品处理和加样洗脱与收集凝胶的保存1、凝胶的预处理：充分溶胀2、层析柱的选择①体积②柱比：层析柱的长度与直径的比（样品的数量、性质、分离目的）3、凝胶柱的装填进胶过程宜连续、均匀、不中断，并不断搅拌。4、样品处理和加样（样品的浓度、黏度）5、洗脱与收集（洗脱液的成分、流速、目的物）6、凝胶的保存（去除杂质）六、高效液相色谱法(HighperformanceLiquidchromatography,HPLC)高效液相色谱法：特指一种以液体为流动相的色谱分离分析方法。它是在经典液相色谱的基础上，引入了气象色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。（一）HPLC的分类和基本原理固定相液-液色谱液-固色谱作用原理液-固吸附色谱液-液分配色谱凝胶渗透或体积排除色谱离子交换色谱亲和色谱1.液-固吸附色谱流动相—液体固定相—固体吸附剂（活性吸附剂）分离机制：被分离的组分分子（溶质分子）与流动相争夺吸附剂表面活性中心，靠溶质分子的吸附系数的差别而分离。与薄层色谱在分离机理上有很大的相似性，主要按样品极性的大小进行分离。2.液-液分配色谱流动相—液体固定相—载体+固定液以液体为流动相，把另一种液体涂渍在载体上作为固定相。分离机制:流动相与固定相互不相溶，两者之间有一明显的分界面，样品各组分借助于它们在两相间的分配系数的差异而获得分离。（与液-液萃取的机理相似）3.离子交换色谱流动相—液体固定相—人工合成的离子