微生物实验教案

第1页共11页《微生物学》实验教学教案[实验项目]实验一微生物学试验常用玻璃仪器洗涤及干热灭菌[教学时数]3学时[实验目的与要求]1．认识微生物实验所需要的各种器皿，了解常用工具和仪器的名称、用途。2．掌握对玻璃器皿的清洗、包扎方法与干热灭菌的操作过程。[实验原理]微生物学实验要求较高的无菌状态，因此，实验所用的器皿，大多数要进行消毒、灭菌从而用以培养微生物，所以对其质量、规格、洗涤和包扎方法均有一定要求。清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防止污染杂菌。干热灭菌的原理，空的玻璃器皿一般用干热灭菌。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。[实验材料与设备]1．培养皿、大试管、三角瓶6只、烧杯（500ml）2只、烧杯（1000ml）1只、小试管6只、吸管（0.2ml2支，0.5ml2支，1ml2支，5ml2支）共8支。2．去污粉、肥皂、清洗剂、毛刷。3．棉花、扎绳、包扎纸。[实验步骤]（一）学习下列常用仪器的种类、规格和应用范围1.培养皿由一底一盖组成一套，常用的培养皿皿底直径90mm，高15mm,皿底皿盖均为玻璃制成。制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种、活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。2.试管(1)大试管(约18mm×180mm):可装倒平板用的培养基，可作制备斜面用（需要大量菌体时用），装液体培养基用于微生物的振荡培养。(2)中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]:装液体培养基培养细菌或做斜面用，用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。(3)小试管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。3.三角瓶规格有100mL、250mL、500mL和1000mL用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等。4.烧杯规格有50mL、100mL、250mL、500mL和1000mL用来配制培养基与各种溶液等。5.吸管规格有0.1mL、1mL、2mL、5mL、10mL用来量取转移各种溶液等。6.量筒规格有50mL、100mL、250mL、500mL。（二）学习玻璃器皿的洗涤方法1.新玻璃器皿的洗涤在2%的盐酸溶液中浸泡数小时，用自来水冲洗干净。2.旧玻璃器皿的洗涤（1）试管、培养皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自来水冲洗A装有固体培养基：刮掉，洗涤B带菌的器皿：2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24小时或煮沸0.5小时，然后洗涤C带病原菌培养物的器皿：先高压蒸汽灭菌，倒去培养物（2）玻璃吸管：吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，反复冲洗A吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：立即投入盛有自来水的容器中浸泡，实验后集中冲洗。B塞有棉花的吸管：用水将棉花冲出，然后冲洗C吸过含有微生物培养物的吸管：2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24小时然后洗D吸管内壁有油垢：洗涤液中浸泡数小时，再冲洗(三)学习各种器皿的包扎1.培养皿的包扎：牛皮纸或旧报纸包紧，一般以5～8套培养皿包成1包2.吸管的包扎：在上端约0.5cm处，塞入一小段1.5cm长的棉花（勿用脱脂棉），目的是避免将外界或嘴中杂菌吹入管内，或不慎将菌液吸出管外。用4～5cm宽的长纸条卷起来3.试管和三角瓶等的包扎：用橡皮塞和牛皮纸。(四)干热灭菌1．装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品（培养皿、吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。物品不要摆太挤，以免妨碍空气流通；不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。2．升温接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。3．恒温当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。干热火菌过程。严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。4．降温切断电源、自然降温。5．开箱取物待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。[指导与训练方案]1.通过本次实验你认识了微生物学实验常用的哪些器皿？2.简述玻璃器皿洗涤的基本要求。3.简述干热灭菌的操作步骤。[实验项目]实验二培养基的制备与灭菌[教学时数]4学时[实验目的与要求]1．了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤。2．了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。[实验原理]培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。从培养基的组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。2.半合成培养基：一部分纯化学物质和一部分天然物质配制而成。3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。从培养基的物理状态可分为:1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2—0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。察氏一号培养基是一种应用最广泛和最普通的霉菌培养基。高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。当蒸汽压达到1.055kg/cm2时，锅内温度可达到121℃，一般维持20min,即可杀死一切微生物的营养体或芽孢，而达到灭菌目的。[实验材料与设备]1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂[实验步骤]1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌关键步骤及注意事项1.要严格按配方配制。2.调pH不要过头。3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC以下放物、取物。4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。[指导与训练方案]1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么?3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么?4.培养基的配制原则是什么?[实验项目]实验三环境和人体微生物的检测及无菌操作技术[教学时数]3学时[实验目的与要求]1.通过检测环境和人体中微生物的存在，体会微生物分布的广泛性。2.学习无菌操作的技术，掌握利用稀释涂布平板法从土壤中分离微生物的方法。[实验原理]自然环境中和人及动物的体表、体内都存在大量的微生物，它们一遇到适合的条件就会大量繁殖。当把取自不同来源的含菌样品接种于含有生长发育需要的各种营养成分的固体培养基时，就会形成肉眼可见的微生物集体群落-菌落。每种微生物菌落都有其独有的特点，如大小、颜色、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑、边缘整齐或不整齐等。因此，可以通过平板培养来检测不同环境下微生物的数量、种类和特点。[实验材料与设备]1.恒温培养箱、磁力搅拌器、移液枪2.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、察氏一号培养基；地面以下5-10cm的土壤；3.酒精灯、无菌棉棒、无菌生理盐水、涂布棒、记号笔、培养皿、吸管、试管、三角瓶[实验步骤]1.无菌操作技术在酒精灯火焰旁操作，将融化并冷却至不烫手的灭菌固体培养基倒入无菌的培养皿，倒量为容积的1/3~1/2或者覆盖皿底5毫米左右，然后平放到桌面待其凝固即为无菌平板。2.土样的稀释分离制备土样悬浊液：称取土样1g，迅速倒入盛有99ml无菌水和玻璃球的三角瓶中，置入磁力棒，搅拌10-15min，使土样充分打散，即成10-2的土壤悬浊液。稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-6的稀释液。(注意：操作时每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。)3.环境及人体各部位取菌样4.标记、培养标记：A-Ⅰ-1-10-5姓名按培养基类别：细菌培养基--A，霉菌培养基--B按3个大组：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、按4个中组：1-4按样品类别：10-5、10-6、口腔--a、鼻腔--b、头发--c、空气--d按个人标记：姓名培养：将接种的平板分别放入细菌和霉菌培养箱中培养。霉菌保持25-27℃，3-5天；细菌35-37℃，1-2天。[指导与训练方案]1、无菌倒平板时注意的事项有哪些？2、平板接种后为什么要倒置培养？3、通过本次试验你学到了什么？有什么体会？[实验项目]实验六细菌的单染色与革兰氏染色[教学时数]3学时[实验目的与要求]1.学习对细菌的涂片、染色和无菌操作技术。2.了解染色原理、学习并掌握单染色和革兰氏染色技术。。[实验原理]细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，染色后，菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物学中常用的是单染色法和革兰氏染色法。染色部位分芽孢、鞭毛、荚膜染色其机理主要是由于两类细菌的细胞壁成分和结构不同。G+菌，肽聚糖多，脂质少，酒精不易进入；G-菌，肽聚糖少，脂质多，酒精易进入[实验材料与设备]1.菌种：E.coli（大肠杆菌）、B.subtilis（枯草芽孢杆菌）、玉米细菌等2.试剂：石炭酸复红染色液、革兰氏染色液(草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、沙黄染色液）3.其他：显微镜、载玻片、生理盐水、酒精灯、接种环、吸水纸、擦镜纸等[实验步骤]一、单染色法：滴无菌水→涂片→自然干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检（高倍镜、油镜）二、革兰氏（Gram）染色法1.涂片2.初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-1.5分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。5.复染：滴加番红染色液，染1-1.5分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：观察染色结果并绘图。[指导与训练方案]1.革兰氏染色过程中大肠杆菌、枯草杆菌、玉米细菌、金黄葡萄球菌等分别被染成什么色，分别为革兰氏反应的什么菌？2.涂片用的玻璃片为什么不得有油污？为什么涂片要求菌膜要均匀、薄？3.革兰氏染色的原理4.染色注意事项有哪些？[实验项目]实验七微生物的显微镜计数、大小测量和酵母菌的死活鉴别[教学时数]5学时[实验目的与要求]1.学习并掌握利用显微镜直接计数的基本方法。2.了解并掌握酵母菌的死活鉴别染色的原理和技术[实验原理]1.两种常用计数方法，即直接计数法（血球计数板计数法）和间接计数法（平板菌落计数法）。本实验是利用血球计数板进行直接计数。2.利用血球计数板，在显微镜下进行计数，由于计数室的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。3.美兰（氧化型呈蓝色，还原型呈无色），活的酵母菌具有将氧化型美兰还原成还原型的能力，故染色后是透明的，而死的酵母菌则被染成了蓝色。计数方法：计数时，通常数五个（或四个）中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，