天麻素在大鼠脑、肝、肾及脑不同区域组织匀浆中的代谢研究

·614·ChinJMAP,2009August,Vol.26No.8中国现代应用药学杂志2009年8月第26卷第8期REFERENCES[1]ZHANGCS,YANGB,WURC,etal.BibliometricalanalysisofChinesemedicalliterature-194casesofdrug-inducedallergicshocks[J].ChinJPharmacoepidemiol(药物流行病学杂志),1999,8(1):9-13.[2]LIUWQ,GUOW.Analysisoncauseofadversedrugreaction(ARDS)ofinjectionofHerbaHouttuyniae[J].ChinJPharmAnal(药物分析杂志),2007,27(6):943-946.[3]ZHANGJ,LIYK,LILD,etal.AcutetoxicityofTween-80,Poloxaamer188andothertwosolubilizersinmice[J].ChinJNewDrugs(中国新药杂志),2008,17(17):1491-1493.[4]TechnicalGuidelinesonstudiesfortheImmuneToxicities(Allergic,LightAllergicReaction)ofChineseMedicineandNaturalMedicine(SecondDraft)[中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光变态反应)研究的技术指导原则][M].2004:19-21[5]ZHANGJ,LIYK,LILD,etal.Sensitizationofbeagledogstohouttuyniacordatadistillationmixtedwiththreesolubilizers[J].ChinJNewDrugs(中国新药杂志),2008,17(17):1494-1498.[6]HESH,XIEH,ZHANGXJ,etal.Inhibitionofhistaminereleasefromhumanmastcellsbynaturalchymaseinhibitors[J].ActaPharmacolSin(中国药理学报),2004,25(6):822-826.收稿日期：2008-10-21天麻素在大鼠脑、肝、肾及脑不同区域组织匀浆中的代谢研究王俏1,2，陈国神1，曾苏2(1.浙江省医学科学院药物研究所，杭州310013；2.浙江大学药学院，杭州310058)摘要：目的研究天麻素在大鼠脑、肝、肾和脑不同区域组织匀浆中的代谢。方法采用体外匀浆孵育，高效液相法测定天麻素代谢物。结果在脑、肝、肾匀浆中，天麻素代谢物苷元(对羟基苯甲醇)的生成反应速度常数分别为0.0305，0.0121，0.1409µg·mL-1·min-1，天麻素在大鼠脑、肝和肾匀浆中的清除率分别为(29.7±2.1)，(10.4±0.8)和(299.5±22.7)µL·min-1·g-1。天麻素在脑、肝匀浆中代谢较慢，在肾匀浆中能被迅速代谢。在脑组织不同区域中，天麻素被代谢生成苷元的反应速度常数以小脑、脑桥与延脑、丘脑3个区比较高，皮层、纹状体、海马3个区比较低，前者为后者的约1.5倍。天麻素在大鼠小脑、丘脑、皮层中的清除率分别为(45.9±7.4)，(39.6±5.6)和(24.4±3.0)µL·min-1·g-1。结论天麻素在非酶体系中稳定，在肝、肾、脑组织匀浆中天麻素可被代谢为天麻苷元。在组织中的代谢，以肾最快，脑次之，肝最小；在脑组织中，天麻素在小脑、丘脑、脑桥与延脑区域代谢速度快于皮层、纹状体和海马区。关键词：天麻素；天麻苷元；对羟基苯甲醇；匀浆；体外代谢；脑中图分类号：R965文献标志码：A文章编号：1007-7693(2009)08-0614-06StudyontheMetabolismofGastrodininRatBrain,Liver,KidneyandDifferentBrainRegionsHomogenateWANGQiao1,2，CHENGuoshen1，ZENGSu2(1.InstituteofMateriaMedica,ZhejiangAcademyofMedicalSciences,Hangzhou310013,China；2.CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)ABSTRACT:OBJECTIVETostudythemetabolismofgastrodin(Gas)inratbrain,liver,kidneyanddifferentbrainregions.METHODSGaswasincubatedindifferenttissuehomogenateat37℃invitro.AnHPLCmethodwasestablishedtodeterminethemetaboliteconcentrationafterincubation.RESULTSTheresultsshowedthevelocityconstantsofformationmetabolite,HBA,were0.0305,0.0121and0.1409µg·mL-1·min-1inbrain,liverandkidney,respectively.TheclearanceratesofGaswere(29.7±2.1),(10.4±0.8)and(299.5±22.7)µL·min-1·g-1inthebrain,liverandkidney,respectively.ThemetabolismrateofGaswasslowinbrainandliver,whileitwasfastinkidney.Inbrainhomogenate,theformationvelocityofHBAwasfastinthecerebellum,thalamus,ponsandmedullaoblongata,andslowinthefrontalcortex,hippocampusandstriatum.Thevelocityconstantsoftheformerswereabout1.5timeshigherthanthoseofthelatters.ClearanceratesofGaswere(45.9±7.4),(39.6±5.6)and(24.4±3.0)µL·min-1·g-1incerebellum,thalamusandcortex,respectively.CONCLUSIONGasisstableinnon-enzymesystemandcanbemetabolizedtoHBAinbrain,liverandkidneyhomogenateinvitro.AndGasismetabolizedmostrapidlyinthekidney.ThemetabolismratesofGasinthecerebellum,thalamus,ponsandmedullaoblongataarefasterthanotherthreebrainregions.KEYWORDS:gastrodin;gastrodigenin;p-hydroxybenzylalcohol;homogenate;metabolisminvitro；brain基金项目：浙江省科技计划项目(2007C33074);浙江省卫生厅青年科技人才基金(2009QN001)作者简介：王俏，女，博士，副研究员Tel:[phone]E-mail:[e-mail]中国现代应用药学杂志2009年8月第26卷第8期ChinJMAP,2009August,Vol.26No.8·615·天麻素(gastrodin，Gas)为名贵药材天麻的有效单体[1-2]，具有镇静、镇痛、抗惊厥、抗癫痫、保护神经细胞等功能[3-10]，临床上应用于神经衰弱、眩晕、头痛的治疗及癫痫的辅助治疗，昀近还发现其对血管性痴呆有效[11-12]。有人认为Gas本身并无中枢作用，需要代谢为苷元(对羟基苯甲醇，p-hydroxybenzylalcohol,HBA)后才发挥作用，因为代谢物HBA具有脂溶性，易透过血脑屏障入脑，可与脑部的苯二氮受体结合[13]；Gas也可部分透过血脑屏障后，在脑内代谢为HBA而发挥作用[14]。近年研究认为Gas和HBA对神经都有保护作用，有利于记忆的巩固和恢复，抗氧化和清除自由基等活性[3-4,15-16]。Gas在肝、肾、脑等主要脏器组织匀浆中的代谢情况，早期用薄层色谱法进行了检测[17]，肾的水解作用昀强，其次为肝和脑。但薄层色谱法灵敏度低且无法定量测定代谢产生的HBA。另外Gas在脑不同区域中的代谢尚未见文献报道。本研究采用高效液相法检测Gas在体外脏器匀浆中的代谢情况，可准确地检测Gas代谢为HBA的量，旨在通过研究Gas在脑、肝、肾组织匀浆及脑组织不同区域匀浆的代谢，阐明Gas在体内脏器特别是脑中的代谢，为Gas作用机制研究提供帮助。1材料与方法1.1仪器和试药岛津LC-10A高效液相色谱仪，双泵，SCL-10A系统控制器，SPD-10A紫外检测器，CTO-10A恒温箱，浙大N2000色谱工作站(浙江大学智能工程研究所)。离心机：上海安亭科学仪器厂(TGL-16C)。水浴恒温振荡器(SHZ-82型，江苏省太仓医疗器械厂)。手持式匀浆仪(PRO200，美国PROScientificInc.)。紫外可见分光光度计(TU1800，北京普析通用仪器有限责任公司)。Gas(纯度99.0%)由广东惠州市东方植物保健科技有限公司提供；HBA(纯度99.5%)由江苏省仪征市鼎信化工有限公司提供；乙腈为色谱纯(MerckKGaA，Germany)；水为双蒸水；其他试剂均为分析纯。1.2色谱条件分析柱：DiamonsilC18柱(4.6mm×250mm，5µm)；流动相：乙腈-水(2.5∶97.5)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：221nm；柱温：33℃。1.3组织匀浆的制备参照文献方法[18-19]，取Sprague-Dawley大鼠(由浙江省实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(浙)2003-0001)，♂，体重220~250g，制备组织匀浆前，动物禁食过夜。次日断头处死，取出肝脏、肾、脑(均在4℃以下操作)，置在冰袋上，用生理盐水洗净，滤纸吸干，称重后加入3倍于器官重量的磷酸生理盐水缓冲液(pH7.4)[20]，于冰浴中制成匀浆。脑不同区域匀浆为取几只大鼠的脑组织，仔细分离脑的不同区域：脑皮层、纹状体、海马区、丘脑、小脑、脑桥与延脑六个区，同上制成匀浆。以Lowry法测定匀浆液的蛋白质浓度[21]。1.4分析方法建立精密称取HBA对照品，用甲醇制成1.90mg·mL-1贮备液。将贮备液用水稀释成系列标准溶液。精密吸取标准溶液10μL，加入至90μL加热灭活的组织匀浆中，混匀，加入100μL甲醇沉淀蛋白，10000r·min-1离心10min，取上清液20μL，直接进HPLC测定。1.5体外代谢实验将4.34mg·mL-1的Gas水贮备液稀释成一系列的标准水溶液，浓度范围为0.14~4.34mg·mL-1，置-20℃保存。取各组织匀浆液1mL置于5mL玻璃试管中，加Gas水溶液(浓度为2.17mg·mL-1)50µL(使成103.3µg·mL-1浓度)，迅速分装于0.5mL的离心管中(每管100µL)，在37℃的恒温振荡器上振荡，于30，60，90，120，150，180min取样，各样品中分别加入100µL甲醇沉淀蛋白，10000r·min-1离心10min，取上清液，直接进HPLC测定。同时进行相同浓度Gas于缓冲溶液中37℃振荡的实验，观察Gas是否水解