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实验二叶绿体的分离及离体叶绿体的还原活性一、实验目的学习制备具有活性的离体叶绿体和测定离体叶绿体还原活性的方法。通过学习分离制备叶绿体的技术方法，加深对希尔反应的理解及对光反应的认识。1、叶绿体的分离:采用离心分级分离。即利用叶绿体的直径和沉降系数与其他细胞器不同的特点，先用低速离心除去细胞碎片，后用高速离心沉降叶绿体。二、实验原理2、希尔反应（Hillreaction）离体的完整叶绿体，在合适的氧化剂（2.6-二氯吲哚叮酚，一种蓝色染料）存在下，当被照光时，可以使水光解释放氧气，接受电子和H+后被还原成无色。实验中可以直接观察颜色的变化，也可用分光光度计对还原量进行精确测定，该变化在4~5min内呈线性关系。光叶绿体2H2O+2A2AH2+O2三、实验材料菠菜叶片四、设备与试剂分光光度计，离心机，照光装置，试管，移液管，烧杯，纱布，研钵等。NaCl、Tris缓冲液、2.6-二氯吲哚叮酚五、实验步骤1.提取叶绿体：称鲜菠菜叶5g，加10ml0.35MNaCl、1mlTris缓冲液、石英砂，研磨。匀浆用脱脂棉过滤。12345用天平将各组滤液调平。1000转/分离心5分钟，取上清液；3000转/分离心5分钟，去除上清液，保留沉淀。在沉淀中加入5mlNaCl，搅匀，得到叶绿体悬浮液。2.希尔反应测定管号0.1MTris缓冲液叶绿体煮沸2.6-二氯吲哚叮酚19.3ml0.2ml——0.5ml29.3ml0.2ml5min0.5ml39.8ml0.2ml————将三支试管中的溶液倒入对应的比色杯中，以3号试管调零，620nm处比色。将比色杯置于光源60cm处照光。每隔1分钟快速读下光密度的变化，连续进行5~6次读数。六、实验结果一二三四五12请对结果作出解释0.00.10.20.30.40.50123456A时间（min）123七、注意事项2.6-二氯吲哚叮酚必须在煮沸加热后滴加。溶液加入比色杯就开始计时。每次测光时都应调零和百分比。八、思考题1.试管中蓝色褪去的原因是什么?与光照有什么关系?2．煮沸对叶绿体有何影响？